糖尿病前期和2型糖尿病患者血浆中差异表达microRNAs的筛选及临床诊断价值研究

摘要

目的：本实验通过分析正常对照组、2型糖尿病（T2D）患者和糖尿病前期患者血浆微小核糖核酸（ miRNA）表达谱的变化，发现差异表达的miRNAs，并从血浆miRNA水平探讨T2D的发病机制，为T2D早期诊断寻找可能的新的生物标志物。　　方法：（1）采集糖尿病前期组、T2D组和健康对照组各3例血浆，提取RNA，利用安捷伦miRNA芯片检测miRNAs表达量，并根据芯片结果，从中挑选两两对比表达均有显著性差异的miRNAs以进行后续验证分析。（2）于2014年3月～2015年10月，收集年龄及性别匹配的、由贵州省人民医院内分泌科门诊确诊为T2D和糖尿病前期病人以及同期健康体检正常者各50例血浆样本，对研究对象的临床数据进行分析，并提取样本RNA，采用SYBR Green法进行实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）验证差异表达的miRNAs在3组样本中的表达情况。（3）在生物信息学数据库—Targetscan、microRNAorg和pita，对miRNA靶基因进行预测，得到在3个数据库均有预测的miRNA靶基因并分析其生物学功能。（4）最后用统计学分析并进一步建立受试者工作曲线（ROC曲线），再通过计算ROC曲线下面积（AUC）来判断每一个miRNA的临床诊断能力。　　结果：（1）同正常对照组相比，空腹血糖（FPG）、餐后2小时血糖（2hPG）和糖化血红蛋白（HbA1c）在糖尿病前期和T2D组中呈现显著性递增（P＜0.0001）。（2）miRNA芯片分析结果发现：在健康对照组、T2D和糖尿病前期中， hsa-miRNA-1249（ hsa-miR-1249）、hsa-miR-320b和hsa-miR-6069呈递减式下调，而hsa-miR-572在T2D、糖尿病前期和健康对照组中递减式下调。（3）通过qRT-PCR验证显示：hsa-miR-1249在健康对照组、T2D和糖尿病前期中呈递减式下调，hsa-miR-320b在健康对照组、糖尿病前期和T2D中呈递减式下调，hsa-miR-572在T2D、糖尿病前期和健康对照组中递减式下调，而hsa-miR-6069未得到验证。qRT-PCR验证结果与芯片结果基本一致。（4）hsa-miR-1249预测到相应靶基因18个，hsa-miR-572找到29个，hsa-miR-320b找到915个，GO和KEGG通路分析得到这些靶基因主要与多细胞有机体的发展、信号转导、细胞分化、凋亡、离子转运、细胞代谢过程调控等生物学功能相关。（5）对于区分T2D和正常对照组， hsa-miR-1249、hsa-miR-320b和hsa-miR-572的AUC值分别为0.784（95％CI：0.685～0.883）、0.946（95%CI：0.906～0.985）和0.843（95%CI：0.766～0.920），而对于区分糖尿病前期和正常对照组，hsa-miR-1249、hsa-miR-320b和hsa-miR-572的AUC值分别为0.887（95%CI：0.818～0.957）、0.635（95%CI：0.525～0.744）和0.69（95%CI：0.580～0.793）。　　结论：本研究获得的T2D和糖尿病前期血浆中存在差异表达的miRNAs（hsa-miR-1249、hsa-miR-320b和hsa-miR-572），可能在T2D早期诊断发挥重要作用，并可能参与了T2D的发生发展。

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英文缩略词表

0 引 言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

2.1 临床数据

2.2 总RNA质量鉴定结果

2.3 芯片杂交扫描结果

2.4 差异表达的miRNA筛选

2.5 qRT-PCR实验质控

2.6 qRT-PCR检测结果

2.7 ROC检测结果

2.7差异表达miRNA的靶基因预测

2.8 靶基因的GO分析结果和Pathway分析结果

3 讨 论

3.1 miRNA与糖尿病的相关研究进展

3.2 基因芯片技术在miRNA水平基因表达的应用

3.3 在T2D和糖尿病前期血浆中差异表达miRNA的探讨

3.4 差异表达miRNA靶基因预测的探讨

3.5 本课题意义、发展前景和不足的探讨

4 结 论

参考文献

综述：microRNA检测在糖尿病诊断中的研究进展

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致谢

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