头花蓼对幽门螺杆菌相关性胃炎模式识别受体及胃肠激素的影响

摘要

目的：本实验通过检测H.pylori感染以及头花蓼治疗后SD大鼠固有免疫应答中重要的模式识别分子TLR4和DC-SIGN的蛋白和基因水平，以及胃肠激素GAS、SS mRNA表达变化，探讨头花蓼抗H.pylori可能的机制和调节和修复的作用，为临床研究治疗H.pylori感染的慢性胃炎及新药的研发提供有价值的实验依据。　　方法:（1）H.pylori SS2000的培养：将SS2000均匀涂布于哥伦比亚血琼脂上，37℃三气培养箱内培养72h，观察细菌生长情况，稳定传代3次后进行H.pylori鉴定；（2）建立H.pylori感染SD大鼠的慢性胃炎动物模型：SD大鼠适应性饲养1w后，将96只SPF级SD大鼠随机分为模型组（70只）、空白组（16只）以及药物空白组（16只），所有SD大鼠禁食不禁水12h，5g/L的NaHCO3和消炎痛混合液进行预处理，雄鼠1.0mL/只，雌鼠0.5mL/只；灌胃后继续禁食不禁水，6h后模型组给予1×109cfu/mL H.pylori SS2000菌液1.5mL，灌胃后禁食禁水4h，隔天灌胃，共5次，空白组及药物空白组以等量的无菌脑心浸液肉汤代替；（3）感染动物模型鉴定：末次灌胃结束后8w，禁食禁水24h，模型组及空白组随机抽取6只SD大鼠进行处死，按照洛桑标准，将胃窦黏膜进行HE染色，观察SD大鼠胃黏膜发生慢性炎症改变；对SD大鼠胃黏膜进行快速尿素酶实验、细菌微需氧培养及改良W-S银染法检测胃黏膜H.pylori的定植。模型组SD大鼠胃黏膜呈现慢性炎症病理改变并有H.pylori定植，证实慢性胃炎动物模型构建成功；（4）药物治疗：成功造模后，将造模组分为4组（16只/组）分别进行头花蓼高、中、低剂量药物连续治疗2w，模型组不予治疗。药物空白组以高剂量头花蓼给正常SD大鼠，空白组正常饲养。末次灌胃2w后，处死SD大鼠取其胃组织（处死前禁食禁水24h），取出胃黏膜组织胃窦部分，将其分为4份，一份装入脑心浸液肉汤保存液中，进行H.pylori微需氧培养；一份进行快速尿素酶实验（试纸法）；一份装入样品保护液中，冻存于-80℃的冰箱中，用于RNA提取；一份放入配好的福尔马林固定液中，进行组织切片，用于HE染色、免疫组化等；（5）头花蓼效果评价：H.pylori的清除率；HE染色观察胃黏膜淋巴细胞浸润情况；（6）以头花蓼效果最好的剂量作为治疗组，采用免疫组化和real-time PCR的方法检测头花蓼治疗前后SD大鼠固有免疫应答中重要模式识别分子DC-SIGN、TLR4的蛋白和基因水平表达变化；（7）采用原位杂交法检测GAS（Gastrin，Gas）、SS（Somatostatin，SS）的mRNA的表达变化。　　结果：（1）H.pylori SS2000鉴定：尿素酶、触酶、氧化酶、革兰染色观察证实确为H.pylori SS2000；（2）接种H.pylori后8w，经模型鉴定，HE染色结果显示模型组SD大鼠胃黏膜均呈现慢性炎症改变，胃黏膜H.pylori培养、胃黏膜快速尿素酶阳性、Giemsa染色有H.pylori定植，证实H.pylori感染SD大鼠慢性胃炎的动物模型构建成功；（3）头花蓼治疗效果：经SD大鼠胃黏膜H.pylori培养结果显示，头花蓼药物不同剂量作用以后，H.pylori的定植密度有不同程度的降低，头花蓼高剂量组（172.29mg浸膏/mL）清除率为91.573％，头花蓼中剂量组（57.43mg浸膏/mL）清除率为78.200%，头花蓼低剂量组（19.14mg浸膏/mL）清除率为76.327%；头花蓼不同剂量对胃黏膜的炎症改善情况有所不同；（4）免疫组化结果显示，TLR4、DC-SIGN主要在胃黏膜上皮细胞胞浆中表达，在空白组中，上皮细胞构成规则的腺体，未见表达，模型组中， TLR4、DC-SIGN表达强阳性，H.pylori上调了TLR4、DC-SIGN的表达水平，分别上调1.6倍和3.2倍(P＜0.01)，经头花蓼治疗后的，阳性表达减弱，分别下调了1.33倍和2.6倍（P＜0.01），头花蓼空白组与空白组相比较，无统计学意义，P＞0.05；（5） real-time PCR结果显示：H.pylori刺激后,模型组的TLR4 mRNA和DC-SIGN mRNA表达量明显上调，分别是2.7倍和3倍(P＜0.05)，经头花蓼作用后，TLR4 mRNA与DC-SIGN mRNA的表达水平有明显的下调趋势(P＜0.05)，分别为1.97倍和1.76倍，空白组与药物空白组无统计学差异；（6）原位杂交显示：感染H.pylori后GAS表达明显升高，阳性表达较空白组多，通过扫描灰度值计算GAS光密度值显示上调1.26倍（P＜0.01），SS表达明显下降，光密度值明显下调1.19倍（P＜0.01），头花蓼作用后GAS下调1.12倍（P＜0.05）；SS表达有轻微程度的升高，但不明显（P＞0.05）。　　结论：（1）头花蓼高剂量对H.pylori清除效果最好，且改善胃黏膜炎症效果良好；（2）头花蓼可能通过调节模式识别受体TLR、DC-SIGN来影响固有免疫平衡；（3）头花蓼可能具有调节胃肠激素GAS、SS平衡的功能。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略词表

0引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结 果

2.1 H.pylori SS2000培养及鉴定

2.2 感染动物模型的鉴定

2.3头花蓼治疗情况

2.4免疫组化检测头花蓼对固有免疫应答模式识别分子的影响

2.5 Real-time PCR法检测对固有免疫应答模式识别分子mRNA表达的影响

2.6 原位杂交检测头花蓼对胃肠激素的影响

3 讨 论

3.1 H.pylori感染SD大鼠慢性胃炎的动物模型构建

3.2头花蓼对H.pylori的清除及保护作用

3.3头花蓼对固有免疫应答模式识别分子的影响

3.4头花蓼对SD大鼠胃肠激素胃泌素、生长抑素的调节

4 结 论

参考文献

综述：中药免疫调节研究进展

作者简历

致谢

学位论文数据集