针对五株放线菌基因组和一个南海沉积物样品宏基因组的基因组挖掘

摘要

微生物天然产物一直是抗生素的重要来源，然而近年来微生物天然产物研究却远远落后于人类的实际需求。近年来，得益于一些关键技术的发展，“基因组挖掘”策略逐渐兴起，并作为传统研究策略的一种强有力的补充手段，逐渐推动了微生物天然产物研究的复兴。
　　本实验室长期致力于构建高质量的微生物天然产物资源库，包括微生物菌种库、微生物天然产物库、放线菌“万株基因组”库以及宏基因组文库，并对其中次级代谢产物进行挖掘。本文基于实验室现有的资源库，从微生物基因组出发，对天然产物及其相关生物合成基因资源进行初步的分析和挖掘。主要获得以下四个成果:
　　1.对五株具有潜力的不同稀有放线菌，包括Amycolatopsis methanolica239T、Verucosispora sp.MS100047、MS100128、MS100137和Astrosporangiumhypotensionis进行基因组测序，并对基因组中次级代谢产物生物合成基因进行挖掘，发现五株放线菌基因组中都含有大量新颖的次级代谢产物基因簇。进一步对部分基因簇可能的产物进行预测分析，得到了一些新颖基因簇的信息，为后续针对产物的研究提供了指导;
　　2.在基因组信息的指导下，我们针对A.methanolica239T进行了次级代谢产物的初步挖掘。在缺Fe3+的环境下获得了铁螯合剂类化合物amychelinA和B。进而发现负责amychelin生物合成起始单元供应的“AmS-Am98”通路的底物选择性具有多样性，基于此特性进行深入研究，初步获得了5个不同的amychelin类似物（2个F取代化合物和3个Cl取代化合物）。进一步对它们进行活性检测，发现其中两个化合物4F-2和4F-4较未经修饰的amychelins活性显著增强(PA感染线虫模型)，4F-2拯救线虫的EC50为7.33μg/mL，而4F-4则针对线虫表现出一定的毒性;
　　3.对三株疣孢菌基因簇信息的挖掘，并结合前期三株菌代谢产物的初步研究结果，我们认为MS100137可能产生更多的新颖proximicin类化合物。在此指导下我们从MS100137的产物中获得了2个新颖的同系物proximicin D和E。进而结合基因组信息和遗传学实验，确定了负责proximicins生物合成的基因簇，并且对其生物合成途径进行了推测。这对以后揭示其详细生物合成机制，并加以改造以获得新颖类似物的研究做出了铺垫;
　　4.分别采用针对PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS和FADH2依赖的卤代酶等的探针引物进行筛选，从实验室构建的南海沉积物样品宏基因组文库中获得了7个PKSⅠ阳性克隆、8个NRPS阳性克隆和11个卤代酶阳性克隆。后续的生物信息学分析表明其中的2个IPKSⅠ类型基因簇（12-5D和N27-1E）和1个PKS-NRPS杂合基因簇(14-4D)可能为完整基因簇，并且所获得的卤代酶新颖性很高。这些结果为我们提供了新型的次级代谢产物相关的新颖基因资源。
　　本文的研究方法和结果，一方面为本实验室后续对资源库的深入挖掘提供了一个切实可行范例;另一方面为天然产物研究提供了一系列的新颖化合物资源和基因资源。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 微生物天然产物的研究现状

1．1．1 微生物天然产物的重要地位

1．1．2 微生物天然产物研究的瓶颈

1．1．3 微生物天然产物研究的紧迫性、必要性和前景

1．2 天然产物生物合成

1．2．1 PKS类

1．2．2 NRPS类

1．2．3 PRPS类

1．2．4 萜类

1．3 微生物天然产物研究策略和相关技术

1．3．1 革命性技术的兴起

1．3．2 微生物天然产物研究策略

1．4 本研究的主要目的内容和意义

第二章 五株放线菌基因组测序及其次级代谢潜能分析

2．1 研究背景

2．2 实验材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 基因组测序概况

2．3．2 A．methanolica 239T次级代谢潜能分析

2．3．3 三株疣孢菌次级代谢潜能分析

2．3．4 Astrosporangium hypotensionis次级代谢潜能分析

2．4 小结与讨论

第三章 基于A．methanolica基因组的化合物发现与研究

3．1 研究背景

3．2 实验材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 A．methanolica 239T产生amychelin类铁螯合剂

3．3．2 Amychelin生物合成机制的初步研究和分析

3．3．3 “AmS-Am98”通路底物特异性不高

3．3．4 非天然amychelin化合物的获得

3．3．5 “非天然”amychelin抗PA感染线虫活性明显增强

3．4 小结与讨论

第四章 疣孢菌MS100137的次级代谢产物及基因的研究

4．1 研究背景

4．2 实验材料和方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 MS100137产生新颖proximicins

4．2．2 Proximicin生物合成基因簇的确认

4．4 小结与讨论

第五章 一个南海样品宏基因组次级代谢基因资源的挖掘

5．1 研究背景

5．2 实验方法和材料

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验方法

5．3 结果和分析

5．3．1 基于PCR的筛选

5．3．2 阳性克隆序列分析

5．4 小结与讨论

第六章 结论和展望

参考文献

在读期间发表文章目录

致谢

附表和附图