利用宏基因组技术研究南海沉积物中MCG类群泉古菌的生理与进化以及β-半乳糖苷酶

摘要

根据16S rRNA基因序列，Carl Woese et al.(1990)将古菌分为两个主类群，泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota)。泉古菌特指超嗜热泉古菌(byperthermophilic Crenarchaeota)。广古菌具有多样化的生理特征，如嗜盐、产甲烷和嗜热等。以氨氧化古菌类群MG-I(Marine Group I)为代表的中温泉古菌(mesophilic Crenarchaeota)的发现表明，古菌系统发育树不只由两个主类群组成。通过对MG-I古菌Cenarchaeum symbiosum、Nitrosopumilus maritimus和Nitrososphaera gargensis的16S-23S rRNA基因、核糖体蛋白和信息加工核心蛋白进行系统发育分析，发现中温泉古菌从超嗜热泉古菌中分离出来，形成独立的类群，这表明中温泉古菌是一个新的古菌门，Brochier-Armanet et al.(2008)将其命名为Thaumarchaeota。
　　 MCG(Miscellaneous Crenarchaeota Group)古菌是中温泉古菌类群之一，其可能也具有独特的基因组和进化特征。MCG古菌在系统发育上分为多个子类群，命名中的“Miscellaneous”意味着这个类群拥有广阔的栖息地范围，包括土壤、淡水、热液口、表层和深层海底沉积物等。到目前为止，MCG古菌还未分离到可培养的菌株，关于MCG古菌的生理信息很少。对MCG古菌的研究仅限于建立在16S rRNA基因序列基础上的系统进化分析。在16S rRNA基因的序列分析上，目前的研究多为MCG序列与其他不可培养古菌类群的系统进化分析，缺少MCG序列与可培养古菌的系统进化分析。因此，需要更多的研究去认识MCG古菌的基因组、生理和进化特征。现在，宏基因组技术被越来越多地用于研究未培养微生物的生理与进化，因此可以应用这一技术来研究MCG古菌。沉积物E505样品采自中国南海水深154 m处0-5 cm海底表层。本文中，通过宏基因组研究南海沉积物E505样品中MCG古菌的生理和进化特征。此外，通过功能宏基因组筛选，研究了E505沉积物中的β-半乳糖苷酶。
　　 一、南海沉积物E505样品的古菌多样性分析
　　 以古菌通用引物Arch21F和Arch958R，构建了南海海底表层沉积物样品E505的古菌16S rRNA基因克隆文库。对144个克隆进行测序，得到121条古菌16SrRNA基因序列。把相似性超过97％的序列归为同一个系统类型，获得了64个古菌系统类型。这些古菌序列可以归为8个类群，包括MG-I(54.5％)、MCG(24.0％)、MBGA(Marine Benthic Group A，2.5％)、MBGB(Marine Benthic GroupB，3.3％)、DHVE6(Deep-Sea Hydrothermal Vent Euryarchaeotal Group6，13.2％)、MBGE(Marine Benthic Group E，0.8％)、MBGD(Marine Benthic Group D，0.8％)和其他未能分类的广古菌(0.8％)。0-5 cm的海底表层沉积物样品具有海水和沉积物的混合物的特点，E505中古菌群落组成也反映了这一特点。该样品中的古菌群落是海水来源的MG-I和以MCG为主的深层海底沉积物古菌的混合物。对不同环境来源的代表性MCG古菌系统类型进行系统进化分析，发现E505样品中的MCG序列主要与来源于热带西太平洋的深层海底沉积物以及Mandovi和Zuari的河口沉积物中的MCG序列聚簇。
　　 二、通过宏基因组研究MCG古菌的生理特征
　　 以E505沉积物为样品，我们构建了一个含有10，652个fosmid克隆的宏基因组文库。以古菌通用引物(Arch21F和Arch958R)对fosmid克隆文库进行序列筛选，得到3个携带古菌16S rRNA基因的fosmid，E6-3G、E37-7F和E48-1C。BLAST比对结果显示，这3个fosmid的16S rRNA基因与已报道的海洋沉积物来源的MCG16S序列具有很高的相似性(identities=98％)，这表明分离到的古菌基因组片段均属于MCG。3个fosmid之间16S rRNA基因序列的相似性在81％-83％，表明E6-3G、E37-7F和E48-1C属于不同的MCG亚纲。用454测序方法对fosmid序列进行了测序。用GLIMMER软件预测fosmid上的ORF，通过搜索NCBI非冗余蛋白质库(nr)和InterPro数据库，对预测的ORF进行注释。E6-3G，长度为38，277 bp，含有1个16S-5.8S-23S rRNA操纵子和30个ORF。E6-3G上的ORFs3-10可能参与细胞壁/细胞膜上N-多糖的生物合成。E37-7F，长度为42，618 bp，含有1个16S-5.8S-23S rRNA操纵子、2个tRNA和41个ORF。E37-7F上的ORFs22、23和27编码3个与甲萘醌/泛醌合成相关的甲基化酶，甲萘醌和泛醌在原核生物的电子传递链中起到电子载体的功能。3个磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶基因(ORFs29、31和32)和1个胆碱激酶基因(ORF24)的存在，表明胆碱可能存在于E37-7F古菌的细胞壁/细胞膜上。E48-1C，长度为34，738bp，含有1个独立的16S rRNA基因、1个tRNA和37个ORF。E48-1C fosmid上的ORF4是一个重金属抗性调控蛋白(ArsR)的同源基因，这表明E48-1C古菌可能对有毒的金属离子表现出抗性。
　　 三、MCG古菌的分子进化分析
　　 以E6-3G、E37-7F和E48-1C fosmid序列为基础，通过对16S rRNA基因和信息加工蛋白进行系统发育分析以及分析共线性和四核苷酸频率，对MCG古菌的进化特征进行了研究。在16S rRNA基因的系统进化树上，中温泉古菌形成单系类群，MCG古菌和MG-I plus relatives在中温泉古菌内部形成两个独立的分枝，这表明MCG古菌是中温泉古菌内的一个新类群。对MCG fosmid上保守的信息加工蛋白进行系统进化分析，也得出了与16S rRNA基因系统进化树相同的结论。通过计算基因组片段的内部四核苷酸频率关系值，对MCG fosmid与已报道的其他中温泉古菌fosmid进行了比较分析，结果表明，MCG基因组是不稳定的。进一步分析MCG fosmid的四核苷酸频率，揭示出MCG基因组片段上含有多个四核苷酸频率异常区域。对位于异常区的基因进行系统进化分析，表明MCG fosmid很可能含有非泉古菌或非古菌来源的外源基因，这可能在一定程度上促成了MCG古菌基因组的低均一性。根据稳定四核苷酸频率的关系值(z-scores)，比较了中温泉古菌、超嗜热泉古菌和广古菌之间的相似性，结果表明MCG和MG-Iplus relatives具有不同的四核苷酸频率，再次表明MCG是不同于MG-I plusrelatives的中温泉古菌类群。此外，比较基因组分析表明，MCG fosmid与已报道的213个古菌基因组片段和91个全基因组之间没有共线性，这表明MCG泉古菌在基因排列方面与已测序的古菌存在显著不同。
　　 四、通过功能宏基因组筛选南海沉积物中的β-半乳糖苷酶
　　 对E505宏基因组文库中的潜在β-半乳糖苷酶进行了功能筛选。共得到11个阳性克隆，对其中的4个(E13-9A、E14-1H、E14-5B和E109-6D)进行了全序列测序。对这4个fosmid进行注释，未找到编码β-半乳糖苷酶的相关基因。但是，这些基因组片段上编码多个未知蛋白且编码区的覆盖度相对较低，以此推测其可能含有新型β-半乳糖苷酶基因。随后，根据转座子插入失活实验、fosmid序列分析以及重组蛋白β-半乳糖苷酶活性检测的结果，确定了fosmid克隆β-半乳糖苷酶活性的来源。其活性是由EPI300宿主染色体DNA lacZ△ M15和整合LacZα-肽基因(来源于不同插入片段和pCC1FOS载体)形成α-互补所产生的。尽管已有文献报道应用该方法成功筛选到新型β-半乳糖苷酶，但是，我们的实验结果表明，以该方法筛选外源β-半乳糖苷酶时存在缺陷。通过功能筛选环境中的β-半乳糖苷酶时，为了避免假阳性克隆的产生，我们对构建宏基因组文库用到的宿主和载体的类型提出了一些建议。