抗LunX和EpCAM抗体肿瘤生物治疗研究

摘要

恶性肿瘤是当今世界威胁人类健康和导致人类死亡的最严重疾病之一，如何有效治疗恶性肿瘤已成为当务之急。近年来，随着肿瘤发病机制从细胞水平到分子水平的进一步认识以及分子生物学技术的发展，分子靶向治疗在临床上取得了显著的疗效。研究癌症发病的分子生物学机制，发现诱发癌变相关的特异性分子，再针对这些特异性的分子给予有力打击，将会大大改善疗效。单克隆抗体药物凭其特异性高和毒性低已经成为分子靶向治疗研究的热点，临床实践表明单克隆抗体卓著的疗效已经把肿瘤的治疗推向一个前所未有的新阶段。
　　21世纪以来，抗体治疗取得了突飞猛进的发展，已经成为血液瘤和实体瘤治疗最成功和最重要的策略之一。目前，抗体杀伤肿瘤细胞的主要机制和策略包括:阻断或激活肿瘤细胞生长或凋亡的信号传导，活化免疫系统介导的肿瘤杀伤，偶联功能效应分子靶向杀伤肿瘤细胞，靶向血管形成或肿瘤基质细胞。一个单克隆抗体进入临床，需对其物理和化学等相关性质进行全面检测和分析;具体地说，包括分析识别的抗原表达水平，发挥的免疫效应功能和影响的信号通路，体内的分布、活性以及半衰期等。但是，决定一个单克隆抗体是否能够成为临床药物的关键是其疗效和安全性。
　　一个单克隆抗体的疗效和安全性主要取决于其识别的抗原靶点，因此寻找合适的治疗靶点成为抗体治疗的主要挑战和瓶颈。理想中的靶向抗原应该是高特异性，高丰度、明确的结构和功能信息等。
　　肺癌已经成为实体瘤中发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一。到目前为止，还没有发现肺癌特异的治疗靶点，因此急需寻找有效的肺癌治疗靶点，从而有利于肺癌的早期诊断以及靶向治疗。肺特异X蛋白（LunX）属于PLUNC家族，前期研究发现LunX mRNA可作为肺癌诊断的特异性生物标志物，而LunX蛋白与肺癌的相关性仍未报道。那么LunX蛋白是否广泛表达于肺癌组织;是否促进肺癌的发生发展;是否可作为肺癌生物治疗的靶标？于是围绕上述三个问题开展靶向LunX治疗肺癌的相关性研究。
　　血液瘤现如今已是儿童和青少年肿瘤的头号杀手。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是公认的恶性肿瘤相关抗原，过表达于肺癌，肝癌，胃癌等恶性实体瘤中，但在大部分正常人上皮细胞中也处于低表达状态。EpCAM已成为多种实体瘤临床免疫治疗的靶点(Munz，Baeuerle et al.2009)。目前，EpCAM及其抗体的临床应用只局限于实体瘤，而其与白血病的相关性至今没有通过大量临床标本进行验证;如果EpCAM过表达于白血病细胞，那么EpCAM可能也是白血病治疗的新型靶点，其抗体也可作为白血病治疗的潜在治疗药物。
　　本文主要从寻找肺癌和血液瘤的治疗靶点展开研究，获得了如下结果:
　　Ⅰ、抗LunX抗体抑制非小细胞肺癌的生长及其转移
　　本研究利用免疫组化技术分析150例肺癌病人的肿瘤组织和癌旁组织LunX蛋白表达水平;应用卡普兰-迈耶曲线分析其中108例病人术后生存周期和LunX表达量的相关性;为了研究LunX与肺癌转移的相关性，通过免疫荧光技术检测83例肺癌病人新鲜引流淋巴结、锁骨上淋巴结穿刺标本和胸水标本中侵袭肿瘤细胞LunX表达水平，以及通过LunX RNA干扰和过表达技术，验证LunX与肿瘤细胞的增殖和转移的相关性。为了进一步研究LunX参与的信号通路，利用免疫共沉淀和免疫印迹技术寻找LunX作用的靶蛋白以及调控的信号通路。最后研制LunX治疗性抗体，通过体外抗体抑制试验以及体内肺癌移植模型小鼠验证LunX抗体的功能。本研究通过上述研究方案取得了如下结果:
　　1.LunX表达于非小细胞肺癌
　　检测肺癌病人的肿瘤组织LunX蛋白表达水平，发现LunX过表达于肺癌组织并且阳性率达到90％，其中LunX蛋白表达越高的患者呈现更差的病理分期和更低的分化状态，并且还发现LunX表达水平越高的病人呈现更低的生存率。此外，在多种肺癌细胞系中都可以检测到LunX的广泛表达。另外，在正常外周肺组织以及乳腺、肝脏、卵巢等其他器官中没有检测到LunX的表达。
　　2.LunX高表达于转移的肺癌细胞
　　肺局部淋巴结和锁骨上淋巴结中转移的肺癌细胞全呈LunX阳性，并且，LunX表达越高的病人，其淋巴结转移的阳性率也越高。此结果提示LunX与肺癌的转移相关。
　　3.LunX促进肺癌细胞的增殖及迁移
　　在不同LunX表达水平的肺癌细胞中，LunX表达水平高的肺癌细胞呈现更强的转移能力。在A549和NCI-H292细胞中，干扰LunX能够明显抑制其增殖、迁移以及侵袭，过表达LunX，反之。
　　4.LunX通过活化14-3-3信号通路促进肺癌细胞的增殖及迁移
　　在肺癌细胞中，LunX直接作用于14-3-3蛋白，并且通过阻断14-3-3的磷酸化促进其形成活化状态的同源或异源二聚体，进而活化下游的Erk1/2和JNK信号通路，最终导致肿瘤细胞的增殖和转移。
　　5.靶向LunX小干扰RNA抑制肺癌的生长和转移
　　在人肺癌原位，皮下瘤以及转移的小鼠模型中，靶向LunX能够抑制原位肿瘤的生长，局部侵袭、远端克隆病灶形成以及远端肿瘤病灶的生长;提示LunX可作为肺癌有效的治疗靶点。
　　6.LunX抗体在体外能够通过抗原抗体的内吞和降解抑制肺癌细胞的增殖及迁移
　　基于肺癌细胞过表达LunX， LunX蛋白存在于细胞膜表面以及LunX促进肺癌的生长和转移，于是制备和筛选了LunX抗体(S-35-8)，发现LunX抗体抑制肿瘤细胞的增殖和转移。LunX抗体的主要抗肿瘤机制是介导LunX蛋白的内吞及降解，进而抑制LunX下游信号通路。
　　7.LunX抗体在肺癌模型小鼠中抑制肿瘤的生长及转移
　　LunX抗体能够明显抑制肿瘤的生长和转移，并呈现剂量依赖性。LunX抗体处理正常小鼠没有出现明显的组织炎症和病理性特征。因此，初步结果显示该抗体在体内毒性较小，为后续抗体的人源化和治疗奠定了基础。
　　综上所述，基于上述LunX蛋白的表达特异性和其促进肿瘤生长与转移的致癌机理，以及LunX体内沉默后的肿瘤抑制以及阻断性抗体的治疗作用，可初步确认LunX作为肺癌治疗的新靶标。该研究中的人源化治疗性抗体有可能对肺癌临床治疗具有重要意义。
　　Ⅱ、抗EpCAM抗体抑制髓系血液瘤的形成
　　本研究利用流式细胞术检测各种类型血液瘤患者的骨髓和外周血标本中EpCAM的表达，以及患者化疗前后EpCAM阳性细胞的比例的变化。另外还通过体内外的克隆形成和成瘤实验，验证EpCAM是否参与血液瘤的形成。制备EpCAM治疗性抗体，并验证其体内抗肿瘤的效应以及机制。获得的结果如下:
　　1.EpCAM表达于髓系白血病和多发性骨髓瘤细胞
　　在髓系细胞白血病和多发性骨髓瘤病人的骨髓标本和外周血标本中检测到EpCAM的表达，而在正常人的骨髓和外周血标本中没有检测到EpCAM的表达。另外，髓系来源的白血病细胞系也呈EpCAM阳性。
　　2.EpCAM+白血病细胞具有更强的化疗药物耐药性
　　在化疗前后的同一病人标本中，EpCAM+细胞占异常细胞的比例在化疗后明显升高，并且EpCAM-细胞比EpCAM+细胞对化疗药更敏感。提示EpCAM促进白血病细胞的耐化疗作用。
　　3.EpCAM抗体抑制白血病肿瘤病灶的形成
　　在K562和HL60皮下瘤模型中，EpCAM抗体能够抑制肿瘤的生长，当抗体浓度递增到80mg/kg（小鼠每千克体重）时，肿瘤病灶能够完全被清除。在尾静脉接种的移植瘤小鼠模型中， EpCAM抗体治疗能够抑制肿瘤在颈部淋巴结和骨髓等部位的形成，并且外周血中的肿瘤细胞数也明显减少。该模型中，抗体能明显延长小鼠的生存周期。
　　4.Macrophage介导抗抗EpCAM抗体的抗肿瘤作用
　　EpCAM抗体的治疗促进了脾脏F/80+Gr-1-的巨噬细胞向肿瘤局部的迁移和聚集，并介导抗肿瘤的过程。
　　综上所述，基于上述EpCAM蛋白的表达特异性和其促进肿瘤形成与耐药性的致癌机理，以及EpCAM抗体的抗肿瘤作用，可初步确认EpCAM可作为髓系白血病治疗的新靶标。该研究中的人源化治疗性抗体有可能对髓系白血病临床治疗具有重要意义。

目录

声明

摘要

符号说明

图序

第一章 绪论 肺癌和白血病生物治疗研究现状

1．1 肺癌研究现状

1．1．1 肺癌的分类

1．1．2 肺癌的诊断

1．1．3 肺癌的发生机制

1．1．4 肺癌相关基因的变化

1．1．5 肺癌的常规治疗

1．1．6 个性化治疗

1．1．7 靶向治疗

1．1．8 肺癌和LunX

1．2 白血病

1．2．1 白血病的分类

1．2．2 白血病发病机制及治疗

1．2．3 白血病干细胞

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 临床标本

2．1．3 质粒

2．1．4 病毒

2．1．5 细胞系及培养基

2．1．6 抗体

2．1．7 蛋白纯化试剂

2．1．8 ELISA试剂

2．1．9 细胞迁移和侵袭试剂和耗材

2．1．10 总RNA提取和RT-PCR相关试剂

2．1．11 免疫荧光和免疫组化试剂

2．1．12 引物

2．1．13 核酸电泳相关试剂

2．1．14 1xPBS(磷酸盐缓冲液)

2．1．15 蛋白表达及其变复性相关试剂

2．1．15 细菌培养相关试剂

2．1．16 SDS-PAGE和West blotting相关试剂

2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 LunX和EpCAM蛋白的表达和纯化

2．3．2 LunX和EpCAM抗体的制备

2．3．3 免疫荧光

2．3．4 免疫酶组织化学技术

2．3．5 West blotting

2．3．6 细胞迁移和侵袭实验

2．3．7 细胞增殖实验

2．3．8 免疫共沉淀

2．3．9 人源肺癌皮下移植小鼠模型

2．3．10 人源白血病皮下移植小鼠模型

2．3．11 人源肺癌尾静脉注射小鼠模型

2．3．12 人源白血病尾静脉注射小鼠模型

2．3．13 人源肺癌原位小鼠模型

2．3．14 小动物成像

2．3．15 RNA提取和RT-PCR

2．3．16 ELISA检测

2．3．17 统计学分析

第三章 实验结果Ⅰ抗LunX抗体抑制非小细胞肺癌的生长和转移

3．1 引言

3．2 LunX特异表达于非小细胞肺癌

3．3 LunX高表达于转移的非小细胞肺癌

3．4 LunX促进肺癌细胞的增殖及迁移

3．5 LunX结合于14-3-3蛋白

3．6 LunX通过活化14-3-3信号通路促进肺癌细胞的增殖及迁移

3．7 LunX促进肺癌的生长和转移

3．8 LunX抗体抑制肺癌细胞的增殖及迁移

3．9 LunX抗体抗肿瘤机制：抗体介导LunX蛋白的内吞及降解

3．10 LunX抗体抑制肺癌的生长及转移

3．11 小结

第四章 实验结果Ⅱ抗EpCAM抗体抑制髓系血液瘤的形成

3．1 引言

3．2 EpCAM表达于髓系白血病细胞

3．3 EpCAM+白血病细胞具有更强的化疗药物耐药性

3．4 EpCAM促进肿瘤形成

3．5 抗EpCAM抗体抑制髓系白血病病灶的形成和生长

3．6 Macrophage介导抗EpCAM抗体的抗肿瘤作用

参考文献

致谢

攻读博士学位期间的主要研究成果

附录