磷酸钙纳米颗粒作为蛋白质载体的研究

摘要

蛋白质能催化生化反应，组成受体和细胞膜通道，提供细胞骨架支持，在细胞内转运分子，是体内功能最多样化的生物大分子。蛋白质药物广泛的应用于癌症治疗、疫苗、再生药物、治疗基因缺陷疾病和成像等领域。然而，由于蛋白质特有的性质，比如较大的体积、不同的表面电势、易受损伤的三级结构，将目标蛋白运载入细胞内有很多阻碍。所以蛋白质运载策略中最大的挑战是在不破坏蛋白质结构和生物活性的前提下将蛋白运载到细胞质。大多数蛋白质运载体系依赖于细胞的内吞作用。因此，被运载的目标蛋白很容易在内体/溶酶体弱酸性的采环境中被降解，进而无法到达目标的亚细胞区域发挥作用。基于以上原因，我们用了一种pH敏感的纳米生物材料，来避免目标蛋白在内体/溶酶体中降解，并有效的释放到细胞质中。磷酸钙纳米颗粒是pH敏感的蛋白质运载体系，有很好的生物相容性和生物降解性。在本论文中，我们以磷酸钙纳米颗粒为基础建立了一种有效的细胞内蛋白质运载体系。
　　我们设计了一种简单低成本的磷酸钙纳米颗粒制备方法，检测了纳米颗粒各方面的性质，包括颗粒粒径、颗粒形态、载药率、包封率、pH敏感性质和稳定性。磷酸钙纳米颗粒有很好的分散性并保持稳定的粒径。在内体/溶酶体的弱酸性环境中，蛋白能很快从颗粒上释放，而在生理环境(pH=7.4)中能保持稳定。
　　然后，我们进一步研究了磷酸钙纳米颗粒的细胞摄取、蛋白在细胞内的释放情况以及颗粒上负载蛋白的生物活性。一方面，我们通过荧光显微镜和流式细胞术来研究磷酸钙纳米颗粒的细胞摄取情况;结果表明颗粒能成功有效的被细胞摄取。由于内体/溶酶体逃逸对于细胞内药物的释放是一个阻碍，我们通过激光共聚焦显微镜观察蛋白在细胞内的释放情况;结果表明蛋白质能成功释放到细胞质中。另一方面，SDS-PAGE实验和圆二色谱分析结果表明由于温和的制备方法，磷酸钙纳米颗粒上释放的蛋白能保持其结构不被破坏。另外，磷酸钙纳米颗粒上释放的KillerRed蛋白保留了其生物活性。以上的实验结果表明磷酸钙纳米颗粒是一种合适的蛋白质载体。

目录

声明

摘要

第1章 绪论(蛋白质运载体系研究进展)

1．1 蛋白质药物

1．2 蛋白质运载体系

1．3 磷酸钙载药体系

1．3．1 pH敏感载药体系

1．3．2 磷酸钙纳米载药体系的性质和制备方法

1．3．2 磷酸钙纳米载药体系的应用

1．4 功能型荧光蛋白KillerRed

1．5 本课题的选题目的及主要研究内容

参考文献

第二章 磷酸钙纳米颗粒作为蛋白药物载体的研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 主要药品和试剂

2．2．2 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 表达superfolder GFP和KillerRed蛋白

2．3．2 制备负载蛋白的磷酸钙纳米颗粒

2．3．3 磷酸钙纳米颗粒的表征

2．3．4 GFP／CaP NPs稳定性检测

2．3．5 GFP／CaP NPs蛋白负载率和包封率的测定

2．3．6 蛋白质在不同pH条件下的释放

2．3．7 磷酸钙纳米颗粒负载蛋白的稳定性研究

2．3．8 MTT法检测磷酸钙纳米颗粒的细胞毒性

2．3．9 磷酸钙纳米颗粒负载KillerRed体外和体内活性检测

2．3．10 荧光显微镜和流式细胞术检测磷酸钙纳米颗粒的摄取效率

2．3．11 GFP／CaP纳米颗粒上的GFP在细胞内的释放和分布

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 磷酸钙纳米颗粒的制备和表征

2．4．2 磷酸钙纳米颗粒的蛋白负载率和包封率

2．4．3 磷酸钙纳米颗粒的稳定性研究

2．4．4 磷酸钙纳米颗粒的pH敏感性质

2．4．5 磷酸钙纳米颗粒负载蛋白的稳定性研究

2．4．6 GFP／CaP纳米颗粒的细胞毒性检测

2．4．7 磷酸钙纳米颗粒负载KillerRed体外和体内活性的检测

2．4．8 磷酸钙纳米颗粒的细胞摄取情况

2．4．9 GFP／CaP纳米颗粒上的GFP在细胞内的释放和分布

2．5 本章小结

参考文献

致谢