壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠肝星状细胞Fas/FasL凋亡信号通路的影响

摘要

目的:本课题主要以研究壮肝逐瘀煎对肝纤维化大鼠 Fas、FasL因子信号调节诱导活化肝星状细胞(Hepatic stellate Cells,HSCs)凋亡的角度出发,进一步探讨壮肝逐瘀煎抗肝纤维化(Hepatic Fibrosis, HF)的作用机制。　　方法:选取102只体重220-250g雌雄各半的清洁级SD大鼠作为实验对象。任意取其中18只作为正常对照组(A组)进行正常喂养,其余大鼠按韩德五法采用CCL4复合因素进行HF造模:在以单纯玉米面及0.5％胆固醇混合而成的高脂低蛋白食物为主食(实验第1、2周还需加入20％花生油),30％酒精为唯一液体补充的饮食诱导基础上,配合皮下注射肝毒剂40％CCL4(第1次以5ml/Kg体重注入,之后每隔3天以3ml/kg体重注入)。实验第4周末,随机于 A组及造模组大鼠中各取4只进行HF相关检验。在结果提示HF形成证实造模成功后,将大鼠平均分为病理模型组(B组),壮肝逐瘀煎大剂量组(C组)、壮肝逐瘀煎中剂量组(D组)、壮肝逐瘀煎小剂量组(E组)、秋水仙碱(F组)及大黄蟅虫丸组(G组),共6组,每组14只。为防止肝脏自然修复对实验结果造成不必要的影响,造模成功后仍继续对大鼠予皮下注射肝毒剂40％CCL4(每周以3ml/kg体重注入)。实验第5周始,A组除按正常饮食外,加以同容积的生理盐水灌胃处理;B组以同容积的生理盐水灌胃处理;C、D、E组以壮肝逐瘀煎灌胃处理,剂量分别为10g/Kg体重、5g/Kg体重、2.5g/Kg体重;F组以秋水仙碱灌胃处理,剂量为100μg/Kg体重;G组以大黄蟅虫丸灌胃处理,剂量为1.5g/Kg体重(灌胃液体量为0.1ml/Kg体重,1次/天,药物浓度及等效剂量按体表面积折算),共给药6周。实验第10周末,所有大鼠在完成最后一次灌胃后禁食12小时,使用1％戊巴比妥钠皮下麻醉,经股静脉采血后将其处死,立即剖取肝脏,在每片肝右叶的大致相同部位取少量肝组织以备作常规石蜡切片,存置于10％福尔马林液中,其余肝脏以备检测蛋白而存置于液氮中。观察实验大鼠的主要症状及体征;肝脏大体形态改变情况;免疫组化法对Fas组织分布进行定性分析;酶联吸附免疫染色法(Elisa)对血清及肝组织中Fas、FasL进行浓度水平检测;实时定量 PCR法(Realtime-PCR)对肝组织FasmRNA、FasLmRNA水平进行检测。　　结果:(1)免疫组化结果显示,壮肝逐瘀煎大剂量组呈强阳性表达,较正常对照组、病理模型组、壮肝逐瘀煎中、小剂量组、秋水仙碱组及大黄蜇虫丸组表达明显增强。(2)酶联免疫吸附染色法结果显示,随着实验时间的延长,与病理模型组相比,壮肝逐瘀煎治疗组及秋水仙碱组均能明显增加大鼠血清及肝脏中HSCs内Fas、FasL的表达(P<0.01),其中以壮肝逐瘀煎大剂量组升高最显著(P<0.01);实验48h壮肝逐瘀煎大剂量组肝脏中HSCs内Fas、FasL的表达较实验24h壮肝逐瘀煎大剂量组明显升高(P<0.01)。(3)Realtime-PCR结果显示,与病理模型组相比,壮肝逐瘀煎各治疗组、秋水仙碱组及大黄蛰虫丸组均能明显下调大鼠肝组织内 FasmRNA、FasLmRNA的 CT比值水平(P<0.01),其中以壮肝逐瘀煎大剂量组的下调最为显著(P<0.01)。　　结论:壮肝逐瘀煎可能通过上调 Fas、FasL蛋白和基因的表达,调控Fas/FasL凋亡信号通路的传导,促进活化HSCs凋亡而达到抗肝纤维化的作用机制。

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引言

第一部分 文献研究

1 现代医学对HF的认识

2 现代医学对HF病因的认识

3 现代医学对HF的诊断及治疗策略

4 祖国医学对HF的认识

第二部分 实验研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第三部分 讨 论

1 对动物模型的认识

2 Fas/FasL介导的凋亡机制及在HF防治中的应用价值

3 壮肝逐瘀煎抗HF的认识

4 壮肝逐瘀煎抗HF机制的可能作用

5 壮肝逐瘀煎抗HF的既往研究成果

结论

参考文献

附录

缩略词表

综述

致谢

个人简历及攻读学位期间获得的科研成果