水牛瘤胃纤毛虫分子生态研究初探

摘要

目的：以水牛瘤胃纤毛虫18S rRNA保守区基因序列为研究对象，采用聚合酶链式反应(PCR)技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析水牛瘤胃纤毛虫种群的遗传多样性。 方法：1、利用蛋白酶K法对水牛瘤胃微生物总DNA基因进行有效地提取。 2、对水牛瘤胃纤毛虫18SrRNA基因PCR扩增方法的比较与优化。由于需要采用特殊的带有“GC夹”结构的引物，所以分别采用常规PCR及降落式PCR对水牛瘤胃纤毛虫18S rRNA基因进行扩增，并用复原条件PCR去除原PCR产物中的异源双链和单链DNA分子。 3、通过变性梯度凝胶电泳技术对扩增的水牛瘤胃纤毛虫18S rRNA基因进行分离，分析水牛瘤胃纤毛虫种群的遗传多样性。 结果：1、利用蛋白酶K消化液消化的方法对水牛瘤胃总微生物细胞进行裂解消化，可以有效地提取水牛瘤胃微生物总DNA。 2、对于引物含有“GC夹”的PCR扩增，降落式PCR提高了扩增反应的特异性和扩增产物的得率，降低了错配现象的产生；通过复原条件PCR对降落式PCR扩增产物进行进一步地扩增，去除降落式PCR扩增产物中的异源双链和单链DNA分子，保证后续变性梯度凝胶电泳技术分离与分析的准确性。 3、通过变性梯度凝胶电泳技术分离水牛瘤胃纤毛虫发现瘤胃纤毛虫种群复杂多样，但没有明显的宿主特异性。经同源性分析和系统发育树分析，所测定的纤毛虫18S rRNA序列之间的同源性在90％以上，与数据库中同源性最高的瘤胃纤毛虫18S rRNA克隆体的同源性在97％-100％之间。其中1条与Epidinium caudatum的同源性高达99.6％，其余均来自未培养或未被鉴定瘤胃纤毛虫。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1反刍动物瘤胃及瘤胃微生物

1.1反刍动物瘤胃

1.2瘤胃微生物

1.3瘤胃微生物的分布

1.4瘤胃纤毛虫与其他微生物的相互关系

1.5瘤胃纤毛虫的主要作用

1.6影响瘤胃纤毛虫数量及种群的因素

2基于核糖体RNA的分子生物学技术在瘤胃微生物研究中的应用

2.1基于核糖体RNA为主的分子生物学技术的基本原理

2.2利用16S rRNA研究瘤胃细菌群体结构及进化关系

2.3利用18S rRNA研究瘤胃纤毛虫群体结构及进化关系

3 PCR-DGGE技术研究瘤胃微生物区系的多样性

3.1 PCR技术的基本原理

3.2 DGGE技术的基本原理

3.3 PCR-DGGE技术的优缺点

3.4 PCR-DGGE技术在瘤胃微生物多样性研究中的应用

4问题与展望

5本研究的主要内容

第一章瘤胃微生物总DNA的提取与检测

1.1实验材料

1.1.1仪器

1.1.2试剂

1.1.3溶液的配制

1.2实验方法

1.2.1瘤胃内容物的采集与处理

1.2.2样品总DNA的提取

1.2.3 DNA提取质量检测

1.2.4琼脂糖凝胶电泳检测

1.3结果与分析

1.3.1 DNA电泳结果

1.3.2 DNA扩增效果检测结果

1.4讨论

1.5小结

第二章含GC发夹引物PCR扩增方法的优化

2.1实验材料

2.1.1仪器

2.1.2试剂

2.1.3溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1常规PCR扩增

2.2.2降落式PCR

2.2.3复原条件PCR

2.2.4琼脂糖凝胶电泳检测

2.3结果与分析

2.3.1常规PCR扩增结果

2.3.2降落式PCR扩增结果

2.3.3复原条件PCR扩增结果

2.4讨论

2.5小结

第三章水牛瘤胃纤毛虫群落多样性的DGGE分析

3.1实验材料

3.1.1仪器

3.1.2试剂

3.1.3溶液的配制

3.2实验方法

3.2.1 DGGE电泳变性剂溶液的配制

3.2.2 DGGE电泳胶的制备

3.2.3 DGGE电泳

3.2.4染色

3.2.5部分优势条带的回收与序列分析

3.2.6 DGGE图谱相似性分析

3.3结果与分析

3.3.1 DGGE分离结果

3.3.2 DGGE指纹图谱聚类分析

3.3.3部分优势条带的序列分析

3.4讨论

3.5小结

第四章全文结论

参考文献

附录 水牛瘤胃优势纤毛虫的18S rRNA测序序列

致谢

攻读学位期间发表论文情况