化学发光功能化纳米材料合成及其在无标记生物分析中的应用研究

摘要

论文首先综述了化学发光、化学发光功能化纳米材料以及无标记化学发光生物分析技术的研究现状和最新进展。近年来，在纳米材料表面富集大量化学发光信号分子，合成发光功能化纳米材料受到人们的广泛关注，其在临床生化分析、食品药品检测、环境监测等领域具有重要应用前景。但是，目前发光功能化纳米材料主要被作为分析探针，构建基于标记技术的生物分析方法。最近，无标记分析方法无需复杂繁琐的标记过程，操作过程简单，能够实现目标分析物的灵敏、快速、低成本的检测，成为生物分析领域一个新的发展趋势。本论文针对化学发光试剂功能化纳米材料以及新型化学发光试剂/催化剂双功能化纳米材料的合成及其在无标记化学发光生物分析中的应用这一研究主题，开展了一系列研究工作。成功利用鲁米诺功能化金纳米和联吡啶钌功能化氧化石墨烯作为无标记传感平台，构建了三个无标记电致化学发光生物分析界面，分别实现了凝血酶、急性心肌梗死标志物心肌肌钙蛋白Ⅰ和结核分枝杆菌特异DNA序列的快速测定。此外，目前所制备的发光功能化纳米材料发光效率有限，为了实现生物体系中超低含量分析物的检测，拟进一步提高发光功能化纳米材料的发光效率。本论文成功合成了N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)/过渡金属离子催化剂双功能化的金纳米材料和ABEI功能化金纳米点/Cu2+双功能化的碳纳米管，对其形貌和表面成分进行表征，研究了其化学发光特性，并基于所合成的双功能化纳米材料，成功发展了两种无标记化学发光生物分析方法，并分别将其应用于焦磷酸根离子和焦磷酸酶的简单、快速检测。主要研究内容如下:
　　1.将鲁米诺功能化金纳米与核酸分子进行可控组装，构建无标记纳米分析界面，基于分析界面上识别分子捕获目标物后引起界面电致化学发光信号的变化作为检测信号，发展了一个无标记电致化学发光适配体传感器用于检测凝血酶。首先，利用Au-S键作用，将修饰了一段DNA链的普通纳米金组装到金电极表面;然后，利用DNA链的杂交反应，将修饰了互补DNA链和凝血酶适配体的鲁米诺功能化金纳米进一步组装到修饰电极表面。该层功能化金纳米可进行分子识别，并产生电致化学发光信号，从而构建了一个无标记纳米传感界面。当凝血酶存在时，适配体捕获凝血酶，导致修饰电极表面产生较大的电子转移阻力，影响界面上鲁米诺分子的电致化学发光反应，造成电致化学发光信号的降低。基于该电致化学发光信号的降低值，可实现对凝血酶的定量测定。对该传感器的分析性能研究表明，该传感器具有5.0 pmol/L至50 nmol/L宽的检测范围和低的检测限1.7pmol/L。将该电致化学发光适配体传感器用于其它蛋白，几乎没有响应，表明该分析方法具有良好的选择性。由于在测试过程中，样品基体可以被分离洗涤去除，因此该传感器具有良好的选择性，可用于人血清样品凝血酶的测定。该传感器还具有普适性，选择相应的蛋白目标物的适配体作为新的组装基元，所构建的适配体传感器还可应用于其它蛋白目标分析物的检测。
　　2.基于鲁米诺功能化金纳米作为抗体载体和纳米传感平台，基于抗原-抗体免疫反应所引起的纳米传感界面上电致化学发光信号的变化值，成功构建了一个适用于急性心肌梗死疾病标志物心肌肌钙蛋白(cTnⅠ)检测的无标记电致化学发光免疫传感器。首先，利用Au-S键作用，将修饰了链酶亲和素的普通纳米金组装到金电极表面;然后，利用生物素-链酶亲和素相互作用，将修饰有cTnⅠ抗体的鲁米诺功能化的金纳米进一步组装到修饰电极表面，从而构建了一个能产生稳定的较强的电致化学发光信号的无标记免疫传感界面。当存在cTnⅠ，传感界面的cTnⅠ抗体捕获cTnⅠ，造成界面电致化学发光信号的降低。基于传感界面ECL信号的变化，可实现对cTnⅠ的直接测定。对该传感器的分析性能研究表明，该传感器可以实现cTnⅠ从0.1到1000ng/mL宽的检测范围内的测定。同时该传感器具有较低的检测限，达到0.06ng/mL。此外，该传感器还可用于实际人血样中cTnⅠ的检测。该方案具有简单、快速、灵敏、特异、稳定等优点。此外，该方案还可扩展用于其它疾病标志物的检测，在临床和药物诊断中具有重要应用前景。
　　3.利用具有电致化学发光活性的Ru-GO发光功能化纳米材料作为悬浮传感界面，基于氧化石墨烯对单链DNA和双链DNA的良好识别能力，利用二茂铁修饰的单链DNA(Fc-ssDNA)作为ECL信号控制单元，成功构建了一个均相电致化学发光DNA传感器，并将其用于多重耐药性结核病特异基因序列rpoB基因的检测。Ru-GO的电致化学发光信号将被吸附于其表面的Fc-ssDNA有效淬灭。耐药性结核病特异性基因序列与Fc-ssDNA发生杂交反应，从而将Fc-ssDNA从Ru-GO表面脱离，Ru-GO的电致化学发光信号得到恢复。基于Ru-GO的电致化学发光信号的变化值，可实现对特异DNA序列的识别和定量。该传感器具有较宽的检测范围，可以实现rpoB基因从0.1nmol/L到100nmol/L的测定，检测限达到0.04nmol/L。通过合理的设计DNA序列，该传感器也可用于其它疾病相关的特异DNA序列以及基因突变的检测，具有很好的应用前景。
　　4.发展了一种新型、简单、便捷的发光试剂/金属离子催化剂双功能化金纳米材料的合成方法。利用ABEI作为模型化学发光试剂，Cu2+作为一种模型金属离子催化剂，利用生物巯基化合物，包括半胱氨酸(Cysteine，Cys)，半胱氨酸-甘氨酸(Cysteinyl-glycine，Cys-Gly)，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)作为新型螯合配体，成功合成了一系列双功能化金纳米材料。在该方案中，首先合成ABEI功能化金纳米，然后通过Au-S键作用将生物巯基化合物组装到ABEI功能化金纳米表面，形成一层高密度螯合配体层。然后，金属离子催化剂，如Cu2+，将被ABEI功能化金纳米表面的螯合配体捕获，从而合成ABEI/Cu2+螯合物双功能化金纳米。研究结果表明，使用Cys作为螯合配体所合成的双功能化金纳米的化学发光强度远大于使用Cys-Gly、Hcy和GSH作为螯合配体所合成的双功能化金纳米的化学发光强度。利用所发展的方法合成的双功能化金纳米Cu2+-Cys/ABEI-AuNPs的化学发光强度比利用前期报道的方法合成的双功能化金纳米DTDTPA/Cu2+-ABEI-AuNPs的化学发光强度提高近1个数量级。此外，该方法所合成的双功能化金纳米在中性pH条件下也能产生化学发光光发射。最后，利用所合成的双功能化金纳米Cu2+-Cys/ABEI-AuNPs作为传感平台，基于焦磷酸根离子与Cys之间对Cu2+的竞争螯合反应，我们成功构建了一个简单、灵敏、高选择性的用于焦磷酸根离子检测的无标记化学发光传感器。该传感器具有较宽的检测范围，可实现焦磷酸根离子从10到100nmol/L范围内的检测，检测限低至3.6nmol/L。我们还成功将该传感器应用于实际入血浆样品中焦磷酸根离子的测定。
　　5.发展了一种简单、有效的发光试剂/Cu2+催化剂双功能化碳纳米管的合成方法，并基于该双功能化碳纳米管的动态合成，开发了一个应用于焦磷酸酶活性检测的化学发光分析方法。首先，利用前期报道的方法，在表面修饰壳聚糖的碳纳米管溶液中，利用ABEI原位还原氯金酸，合成高密度ABEI-金纳米点修饰的壳聚糖碳纳米管(ABEI-Au-cs-CNTs)。然后，基于壳聚糖以及碳纳米管对Cu2+的优良配位和吸附能力，将金属离子催化剂Cu2+进一步组装到ABEI-Au-cs-CNTs表面，从而合成新型具有高效化学发光活性的双功能化碳纳米管ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs。ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs的化学发光强度比前期合成的ABEI-Au-cs-CNTs的化学发光强度高近2个数量级，ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs的电致化学发光强度则比ABEI-Au-cs-CNTs的电致化学发光强度高2倍。焦磷酸根离子可以与Cu2+形成稳定的螯合物，从而阻碍ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs的成功合成。当加入焦磷酸酶后，焦磷酸根离子将被催化水解为磷酸根，释放Cu2+。所释放的Cu2+可被高效、快速、有选择性的结合，组装得到化学发光强度大大增强的ABEI-Au/Cu2+-cs-CNTs。体系化学发光的增强值与所加入的焦磷酸酶的活性单位相关，因此可以实现焦磷酸酶从0.025 U到0.5U活性单位的检测，检测限为9mU。该分析方法还被成功应用于PPase活性抑制剂的监控和浓度检测。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 化学发光研究概论

1．2．1 化学发光的基本概念

1．2．2 化学发光分析原理

1．2．3 常见液相化学发光体系

1．3 化学发光功能化纳米材料

1．3．1 发光功能化纳米材料概述

1．3．2 发光功能化纳米材料的主要类型及其应用研究

1．4 无标记化学发光生物分析方法

1．4．1 无标记化学发光生物分析方法概论

1．4．2 无标记化学发光生物分析方法主要类型

1．4．3 基于发光功能化纳米材料的无标记生物分析技术

1．5 本课题的提出

参考文献

第二章 基于鲁米诺功能化金纳米与核酸组装的无标记电致化学发光适配体传感器检测凝血酶

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与溶液

2．2．2 仪器设备

2．2．3 金纳米-DNA捕获探针1复合物的制备

2．2．4 鲁米诺功能化金纳米-DNA捕获探针2／凝血酶适配体复合物的制备

2．2．5 无标记适配体传感器的构建

2．3 结果与讨论

2．3．1 无标记适配体传感器的构建与表征

2．3．2 检测条件优化

2．3．3 传感器的分析性能研究

2．3．4 传感器的选择性研究

2．3．5 无标记电致化学发光适配体传感器的实际应用能力

2．4 结论

参考文献

第三章 基于鲁米诺功能化金纳米的无标记电致化学发光免疫传感器检测心肌肌钙蛋白Ⅰ

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂与溶液

3．2．2 SA-金纳米修饰电极的制备

3．2．3 生物素化cTnI抗体-鲁米诺功能化金纳米复合物的制备

3．2．4 无标记电致化学发光免疫传感器的构建

3．2．5 ECL检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 无标记ECL免疫传感器的构建

3．3．2 传感器构建过程表征

3．3．3 传感器检测条件优化

3．3．4 传感器的分析性能研究

3．3．5 无标记电致化学发光免疫传感器的选择性研究

3．3．6 无标记免疫传感器的实际应用研究

3．4 结论

参考文献

第四章 基于联吡啶钌功能化氧化石墨烯的均相DNA传感器检测结核分枝杆菌rpoB序列

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与溶液

4．2．2 仪器设备

4．2．3 Ru-GO的合成

4．2．4 rpoB基因的检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 无标记DNA传感器构建过程

4．3．2 电致化学发光DNA传感器的实验条件优化

4．3．3 DNA传感器分析性能研究

4．3．4 传感器的选择性研究

4．4 结论

参考文献

第五章 N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺／Cu2+催化剂双功能化金纳米的合成及其应用于焦磷酸根离子检测

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 试剂与溶液

5．2．2 双功能化金纳米(BF-AuNPs)的合成

5．2．3 DTDTPA／Cu2+-ABEI-AuNPs的合成

5．2．4 化学发光检测

5．2．5 PPi测定

5．3 结果与讨论

5．3．1 双功能化金纳米的合成

5．3．2 双功能化金纳米合成方法比较

5．3．3 pH对双功能化金纳米化学发光强度的影响

5．3．4 螫合配体对双功能化金纳米化学发光强度的影响

5．3．5 金属离子催化剂对双功能化金纳米化学发光强度的影响

5．3．6 基于Cu2+-Cys／ABEI-AuNPs检测PPi

5．4 结论

参考文献

第六章 ABEI／Cu2+催化剂双功能化碳纳米管的合成及其用于焦磷酸酶活性检测

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 试剂与溶液

6．2．2 ABEI-Au／Cu2+-cs-CNTs的合成

6．2．3 PPase活性检测

6．2．4 化学发光检测

6．3 结果与讨论

6．3．1 ABEI-Au／Cu2+-cs-CNTs的合成与表征

6．3．2 ABEI-Au／Cu2+-cs-CNTs的化学发光和电致化学发光特性研究

6．3．3 基于ABEI-Au／Cu2+-cs-CNTs的动态合成检测PPase活性

6．4 结论

参考文献

全文总结

攻读学位期间发表的和待发表的学术论文

致谢