铜绿假单胞菌蹭行运动和表面感知机制的研究

摘要

致病菌可在多种人体器官、组织表面形成生物膜(biofilm)，如:肺、尿道、口腔、结膜、骨膜等。生物膜的形成将导致多种难以用抗生素治疗的急、慢性感染，从而严重威胁人类的健康。研究指出生物膜的发展过程(life cycle)主要包括:1）浮游的细菌在表面的初始粘附;2）初始粘附的细菌经过对表面的适应和表型转换变为牢固附着在表面的细菌;3）微菌落(microcolony)的形成、发展;4）生物膜的成熟;5）成熟的生物膜从新放出浮游的细菌。对生物膜形成机制的深入理解和认知将帮助人们找到防治生物膜的新策略。在此大背景下，我们系统的研究了两个在生物膜形成的初期过程中发挥着重要作用的主题，其中包括:1）细菌是如何利用蹭行运动(twitching motility)实现表面适应的;2）在接触表面后是什么外部信号触发了细菌的表型转换(phenotype switch)。
　　主题1:
　　前期的研究指出成熟生物膜的空间结构在一定程度上取决于生物膜形成初期过程中细菌在表面上的蹭行运动，例如:研究发现关键营养元素铁的缺失将促进铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在表面上的蹭行，导致细菌在表面上过度的分散令微菌落无法进一步形成，恢复铁元素的供给可抑制过度的蹭行令微菌落重新形成。前期的研究虽明确指出生物膜的形成过程依赖于蹭行运动的方式，但细菌是如何通过对个体蹭行运动的调控而实现对生物膜形成过程的调控，该内在机制至今仍不明晰。针对以上问题，我们运用基于显微镜的高通量、原位观测技术，在多种营养条件下对近万个铜绿假单胞菌在表面上的蹭行运动进行了追踪和量化。高通量的数据分析表明铜绿假单胞菌存在四种截然不同的蹭行方式，且细菌所偏好使用的蹭行方式强烈依赖于细菌所处环境的营养条件。通过一简单运动模型，即:将细菌使用分布在头尾两极上四型菌毛(typeⅣ pili)的概率与蹭行运动关联，我们利用计算机模拟的方法完全重现了实验中所观察到的四种蹭行方式，从而阐明了细菌可通过调控菌毛使用概率的对称性来实现在表面截然不同的蹭行运动。后续实验中，我们还证明了铜绿假单胞菌是通过调控蛋白FimX在菌内的对称性实现对菌毛使用对称性的调控。进一步，我们还发现铜绿假单胞菌在贫瘠环境中，菌内FimX倾向在单级分布（不对称分布），从而导致细菌倾向于使用可令细菌在表面快速分散的蹭行方式;而在养料充足的环境下，菌内FimX则倾向在双级分布（对称分布）或者不表达，从而导致细菌倾向于使用可令细菌停驻的蹭行方式。这一发现揭示了铜绿假单胞菌可通过调控其两极上菌毛使用的对称性完成对多种不同环境的适应，采用不同蹭行方式可帮助细菌选择在适当的条件下形成生物膜。以上策略极大地增强了铜绿假单胞菌在自然界中的生存竞争能力。
　　主题2:
　　是什么因素触发了初始粘附在表面的细菌从倾向运动的浮游表型变为倾向停驻、粘附的表型？这一关系到生物膜是否可形成的关键科学问题至今尚无明确答案，研究者对这一因素提出众多不同猜想，如:通过鞭毛或者菌毛的机械感应表面去触发该表型转变，或存在特点胞外感应蛋白、信号分子等猜想。研究表明:在该表型转换前后，菌内的第二信使分子(second messenger)环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)的浓度分别处于低或高两种不同状态。我们利用其他研究者开发的基于荧光共振能量转移(FRET)的单分子荧光探针，在铜绿假单胞菌中实现了对单细胞(single cells)内环鸟苷二磷酸浓度的实时监测。我们的数据显示浮游的铜绿假单胞菌粘附在表面后，其胞内环鸟苷二磷酸浓的度经历了先平稳，再上升，再平稳的转变过程。我们还发现了环鸟苷二磷酸浓度的上升过程严格依赖于细菌在表面的密度。在后续实验中，我们相继证明了这一转变过程不依赖于细菌的物理接触、群体感知信号(quorum sensing signaling)的开启、养料供应的不足以及代谢废物累积等这些在细菌表面密度逐渐增大时不可避免出现的因素。我们的初步结论建议环境中氧气含量可能是诱导这一转变发生的关键性因素，我们并探讨了可能的分子机制。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 21世纪微生物科学的风貌和面临的主要问题

1．1．1 认识领域的问题

1．1．2 应用领域的问题

1．1．3 不得不提的合成生物学

1．1．4 第一部分小结

1．2 回到本论文的主线，生物膜和细菌运动的问题

1．2．1 生物膜简介和研究现状

1．2．2 细菌运动简介和研究现状

1．2．3 微生物研究领域的新方法

1．2．4 本课题的研究意义

第二章 细菌蹭行运动的高通量分析

2．1 本章概述

2．2 绿脓杆菌在表面上蹭行运动数据的高通量获取

2．2．1 细菌培养

2．2．2 Flow cell在线观测

2．2．3 细菌蹭行运动视频的采集

2．2．4 图像数据的分析

2．2．5 原始数据的前期处理

2．2．6 角速度的计算和细菌运动是否翘起的分割

2．2．7 细菌生长、运动等各参数的计算

2．2．8 运动轨迹和运动速度的评价

2．2．9 几种特殊运动方式举例

2．3 数据库的结构及查阅方法

2．3．1 数据库的结构

2．3．2 数据库的查阅方法

2．4 数据库分析的应用举例—群体感知过程对细菌运动的影响

2．4．1 本章小结

第三章 细菌蹭行运动的多样性及环境响应性

3．1 本章概述

3．2 细菌蹭行运动的多样性及分类

3．2．1 第Ⅰa类，单极粘附的细菌

3．2．2 第Ⅰb类，两极粘附快速爬行的细菌

3．2．3 第Ⅱa类，两极粘附原地挣扎的细菌

3．2．4 第Ⅱb类，原地不动的细菌

3．3 不同养料环境对细菌表面爬行行为的影响

3．4 FimX蛋白对细菌爬行的决定性作用

3．5 实验部分

3．5．1 构建铜绿假单胞菌变种

3．5．2 FimX蛋白分布的不对称性计算以及在不同营养条件下的观察

3．6 本章小结

第四章 蹭行运动模型的建立及模拟

4．1 本章概述

4．2 运动模型的建立

4．2．1 细菌蹭行的基本原理以及berg实验

4．2．2 蹭行运动模型的建立

4．3运动模型的计算机模拟

4．3．1 运动数据的抽样和菌毛拉力分布的分析

4．3．2 细菌蹭行运动的计算机模拟过程

4．4 蹭行运动的模拟结果以及与实验结果的比较

4．4．1 不同β、γ参数对模拟结果的影响

4．4．2 模拟结果的统计

4．4．3 模拟结果与实验的比较

4．5 对蹭行运动多样性的理解和模拟

4．5．1 对蹭行运动多样性的理解——随机性和保险假设

4．5．2 保险假设猜想的计算机模拟

4．6 本章小结

第五章 铜绿假单胞菌表面感知机制的研究

5．1 本章概述

5．2 实验结果

5．2．1 对sensor的优化

5．2．2 细菌表面粘附后sensor的FRET比值随时间的变化情况

5．2．3 fret比值转变因素的筛选

5．2．4 氧气对c-di-GMP sensor的可能影响

5．3 实验方法和步骤

5．3．1 拍照条件和设备

5．3．2 变种的构建

5．3．3 图像处理

5．4 本章小结

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果