Spt4:Spt5结合DNA以及抗体E9结合ErbB2的结构生物学研究

摘要

基因表达是一个复杂并且受到多重调控的精细过程，包括了转录、翻译和翻译后修饰三个过程，并受到多种蛋白质复合物的调控。基因表达的第一步是转录，由RNA聚合酶催化，将遗传信息从DNA传递到RNA。调节基因转录的蛋白质被称作转录因子，转录因子在原核、古核、真核三界中的保守程度并不高，但唯一例外的是Spt5/NusG家族。Spt5（原核中被称作NusG）是唯一在三界中都存在的转录因子。在古核和真核生物中，Spt5可以和Spt4形成稳定的异二聚体发挥功能;但在原核生物中并不存在Spt4的同源蛋白，因而NusG独自发挥功能。前人的工作已经证明，Spt4∶Spt5复合物与RNA聚合酶直接相互作用，并结合在RNA聚合酶clamp结构域的coiled-coil模体上。Spt4∶Spt5所处的这一位置位于DNA出口处，在这里，完成了转录的DNA重新形成双螺旋结构，并通过DNA出口排出。
　　在本次工作中，我们通过核磁共振化学位移扰动和荧光偏振实验首次证实了Spt4∶Spt5结合DNA的能力;并通过解析和分析MjSpt4∶Spt5的晶体结构，猜测了一个位于Spt4∶Spt5上可能的DNA结合区域;并从两套衍射数据解析的模型中捕捉到了Spt4∶Spt5两种不同的构象，进而分析了两种构象对Spt4∶Spt5结合DNA能力的影响;通过结合定点突变和荧光偏振实验，我们最终构建了一个Spt4∶Spt5结合DNA的模型，进而构建了一个包含了RNA聚合酶、Spt4∶Spt5复合物和DNA三个元素的RNA聚合酶DNA出口模型，并通过生化实验和计算机模拟验证了此模型的正确性。
　　ErbB2隶属于酪氨酸蛋白激酶家族中的表皮生长因子受体亚家族，这类跨膜蛋白通过胞外结构域的二聚化激活其胞内区的酪氨酸激酶活性，进而互相催化对方的胞内结构域C末端尾巴并进一步激活下游信号通路。ErbB2负责调控包括细胞复制和凋亡的多条重要信号通路，其活性异常会导致乳腺癌等近十种癌症，并有着更高转移性。因而，近年来ErbB2成为了抗肿瘤治疗的重要靶标分子。
　　中国科学技术大学的细胞与分子免疫学实验室近年来一直致力于抗ErbB2抗体的研发，并开发了一株具有抗肿瘤活性的人鼠嵌合抗体chA21。近期，该实验室完成了对chA21的人源化，并通过亲和力成熟技术制备了具有高亲和力的人源化抗ErbB2抗体E9。我们与细胞与分子免疫学实验室合作，通过X射线衍射方法解析了E9 scFv片段与ErbB2完整胞外结构域的晶体结构，确认了E9在ErbB2上的结合位置;并发现在抗原—抗体结合界面上，原先chA21所结合的抗原表面三条loop变成了两条，解释了E9亲和力提升的原因;结合ELISA和肿瘤细胞增长抑制试验阐明了抗体CDR区相对距离对E9抗肿瘤能力的影响，进一步补充了E9下调ErbB2模型的细节。

目录

声明

摘要

第1篇 转录因子Spt4:Spt5复合物结合DNA的结构与功能研究

第1章 综述：Spt4:Spt5复合物与DNA转录调控

1．1．1 概述：DNA转录和RNA聚合酶

1．1．2 转录调控和转录因子

1．1．3 古核生物的转录以及调节

1．1．4 Spt4:Spt5复合物的构成

1．1．5 转录因子Spt5／NusG的生物学功能

1．1．6 Spt4:Spt5生物学功能的结构基础

1．1．7 Spt4:Spt5与其它转录因子

第2章 实验结果与讨论

1．2．1 詹氏甲烷球菌Spt4:Spt5复合物，及相关结构域的表达和纯化

1．2．2 MjSpt4:Spt5复合物结合DNA能力的检测

1．2．3 MjSpt4:Spt5晶体生长，以及数据收集、处理

1．2．4 MjSpt4:Spt5复合物晶体结构的解析和模型优化

1．2．5 晶体结构的模型质量

1．2．6 MjSpt4:Spt5的整体结构

1．2．7 MjSpt4:Spt5展示了两种不同的KOW结构域的构象

1．2．8 基于结构信息对埘Spt4:Spt5结合DNA能力的分析与讨论

1．2．9 MjSpt4:Spt5的DNA结台模型

1．2．10 RNA聚合酶的DNA出口位置模型

1．2．11 展望

1．2．12 本篇小结

第3章 实验材料、设备及实验方法

1．3．1 实验材料及设备

1．3．2 实验方法

参考文献

第2篇 人源化抗体E9与抗原ErbB2相互作用的结构基础

第1章 综述：抗癌治疗靶点ErbB2及其研究进展

2．1．1 ErbB2是EGFR家族成员

2．1．2 ErbB2的生物学功能和结构基础

2．1．3 ErbB2的过表达与肿瘤发生

2．1．4 针对ErbB2的免疫疗法

2．1．5 chA21到E9-开发历程

第2章 实验结果与讨论

2．2．1 人源化抗体E9 scFv和抗原ErbB2 ECD的纯化以及复合物结晶

2．2．2 scFv-ECD复合物晶体衍射数据的收集和处理

2．2．3 scFv-ECD复合物晶体结构的解析和模型优化

2．2．4 晶体结构的模型质量

2．2．5 scFv-ECD复合物的整体结构

2．2．6 scFv-ECD复合物结合界面

2．2．7 VL loop Ⅰ构象的改变提升了E9 scFv对抗原的亲和力

2．2．8 E9抗体CDR区之间的距离与其肿瘤抑制能力

2．2．9 总结和展望

2．2．10 本篇小结

第3章 实验材料、设备与实验方法

2．3．1 实验材料及设备

2．3．2 实验方法

参考文献

致谢