整合RNA-seq和全基因组测序数据解析控制湖羊睾丸发育的基因和调控网络

摘要

繁殖力是肉羊生产中最重要的经济性状之一，早期选育优秀种公羊对遗传改良肉羊群体的繁殖力，提高经济效益尤为重要。睾丸是雄性哺乳动物特有的生殖器官，因其容易测定、遗传力高，并与精液品质密切相关等特点而受到育种学家们的关注，通过睾丸大小的早期选育被认为是提高公羊繁殖力最有效的途径。睾丸的发育是一个高度复杂而精密的过程，需要对其遗传机制进行解析。本研究利用苏木精-伊红染色、透射电镜对湖羊性成熟后不同大小睾丸组织形态学进行了观察；同时利用RNA-seq技术对湖羊不同发育阶段和性成熟后不同大小睾丸组织进行差异mRNA、miRNA和piRNA分析；对207只羊进行基因组重测序，利用全基因组关联分析（Genome-wideassociationanalysis，GWAS）方法筛选与睾丸大小相关的分子标记和候选基因；以期找到控制湖羊睾丸发育和大小的核心基因和调控网络。本论文得到研究结果如下：　　（1）本研究对6月龄湖羊不同大小睾丸组织进行组织形态学观察，HE染色显示质量大的睾丸组织曲细精管上皮生精细胞排列层次分明，管腔有精子产生，质量小的睾丸生精上皮生殖细胞少，管腔内无明显精子产生；透射电镜（TEM）结果显示大睾丸组生殖细胞与生殖细胞之间的胞质桥要明显大于小睾丸组。　　（2）利用RNA-seq技术对初生（M0）、3月龄（M3）、6月龄（M6）、12月龄（M12）4个阶段湖羊睾丸组织进行转录组分析，发现M3vsM0、M6vsM3、M12vsM63个相邻发育阶段的差异表达基因（Differentiallyexpressedgene，DEGs）分别为4606（上调2381个、下调2225个）、7500（上调4368个、下调3132个）和15个（上调8个，下调7个）。GO和KEGG分析显示差异表达基因主要富集在精子发生、授精、减数分裂等条目以及Focaladhesion、ECM-receptorinteraction、RapIsignalingpathway等通路。权重共表达网路分析鉴定到10个与睾丸发育相关的核心基因。利用Western-blot的方法对其中两个核心候选基因在蛋白水平进行研究，发现VIM蛋白在初生时表达量最高，随着月龄推移，表达量逐渐下降；SPATA6蛋白在随着月龄表达量逐渐上升，并且在6月龄表达量最高，显著地高于初生期和3月龄。提示这两个基因在睾丸发育过程中起着重要的作用。　　（3）从137只统一饲养至165日龄的湖羊群体中挑选出睾丸最大的3个个体（大睾丸组，睾丸质量为480.91±25.07g），中间个体3个（中睾丸组，睾丸质量为220.86±1.50g），睾丸最小的个体3个（小睾丸组，睾丸质量为62.70±28.38g）进行RNA-seq测序，分析差异表达mRNA、miRNA和piRNA。结果显示小睾丸组vs中睾丸组、小睾丸组vs大睾丸组、中睾丸组vs大睾丸组分别筛选到7019个（4143个上调、2876个下调）、7101个（4279个上调，2822个下调）和1个差异表达基因；三个比较组差异表达miRNA分别为445个（419个上调、26个下调）、127个（126个上调、1个下调）、2个（均下调）；3个比较组差异表达piRNA分别为293个（290个上调、3个下调）、456个（453个上调、3个下调）、75个（59个上调、16个下调）。整合分析miRNA、piRNA和mRNA数据，鉴定得到154个miRNA-mRNA和1个piRNA16763_X1—XG—unconservative_26_2286849（unconservative_17_1152267）调控睾丸大小的候选互作网络。　　（4）对207只6月龄湖羊进行全基因组重测序，并与睾丸大小及衍生性状开展GWAS，筛选到194个显著相关的SNPs（P＜10-6），注释到183基因。其中与左侧睾丸重量、长度、宽度显著相关的SNPs主要位于4、6、15、27号染色体；与右侧睾丸重量、长度、宽度显著相关的SNPs主要位于2、3、6、9、12、15染色体。基因注释分析显示THEG、APOL3、PATZI、POU5F1等是决定绵羊睾丸大小的候选基因，可以作为分子辅助标记，指导绵羊分子育种。

目录

声明

缩略语

第一章 文献综述

1.1 睾丸发育过程

1.2 睾丸发育过程基因组学研究进展

1.2.1睾丸发育不同阶段差异表达mRNA的鉴定

1.2.2 睾丸发育过程miRNA的鉴定及调控

1.2.3 睾丸发育过程piRNA的鉴定及调控

1.3 睾丸发育过程相关蛋白的鉴定

1.3.1 特定时期睾丸组织或细胞蛋白质的鉴定

1.3.2 不同发育期睾丸组织或生殖细胞蛋白质的鉴定

1.4 睾丸大小GWAS研究进展

1.5 研究目的及意义

1.6 研究内容

1.7 技术路线

第二章 6月龄湖羊不同大小睾丸组织形态学分析

2.1 材料与方法

2.1.1 试验动物及设计

2.1.2 试剂和仪器

2.1.3 试验方法

2.2 试验结果和分析

2.2.1 HE染色分析

2.2.2电镜分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 基于RNA-seq技术筛选与湖羊睾丸发育相关的候选基因

3.1 材料与方法

3.1.1 试验动物及设计

3.1.2 试剂和仪器

3.1.3 试验方法

3.2 试验结果和分析

3.2.1 测序reads的分析

3.2.2 测序reads在参考基因组分布

3.2.3 差异表达基因的获取

3.2.4 GO富集分析

3.2.5 KEGG富集分析

3.2.6 AS分析

3.2.7 WGCNA分析

3.2.8 qRT-PCR验证差异基因

3.2.9 Western blotting分析差异表达基因在蛋白水平的表达特征

3.3 讨论

3.3.1 测序reads质量

3.3.2 比对效率

3.3.3 差异表达基因及蛋白水平特征分析

3.3.4 GO和KEGG富集分析

3.3.5 AS分析

3.3.6 WGCNA分析

3.4 小结

第四章 湖羊不同大小睾丸转录组测序分析

4.1 材料与方法

4.1.1 试验动物及设计

4.1.2 试剂和仪器

4.1.3 试验方法

4.2 试验结果与分析

4.2.1 测序reads的获取

4.2.2 差异表达基因获取

4.2.3 GO富集分析

4.2.4 KEGG富集分析

4.2.5 AS分析

4.2.6 SNP分析

4.2.7 qRT-PCR验证结果

4.2.8 Western blotting分析差异表达基因在蛋白水平的表达特征

4.3 讨论

4.3.1 测序reads质量

4.3.2 差异基因的分析

4.3.3 GO、KEGG功能富集分析

4.3.4 AS 分析

4.3.5 SNP分析

4.4 小结

第五章 绵羊不同大小睾丸小RNA测序及相关miRNA的验证

5.1 材料与方法

5.1.1 试验动物及设计

5.1.2 试剂和仪器

5.1.3 试验方法

5.2 试验结果和分析

5.2.1 测序reads的分析

5.2.2 测序reads在参考基因组分布

5.2.3 miRNA序列特征分析

5.2.4 piRNA序列特征分析

5.2.5 small RNA相关性分析

5.2.6 DE miRNA获取

5.2.7 DE piRNA获取

5.2.8 DE miRNA靶基因预测及靶基因注释

5.2.9 piRNA靶基因预测及靶基因注释

5.2.10 DE miRNA GO富集分析

5.2.11 DE piRNA GO富集分析

5.2.12qRT-PCR检测DE miRNA

5.3 讨论

5.3.1 测序reads序列特征分析

5.3.2 DE miRNA、piRNA分析

5.3.3 DE miRNA、piRNA靶基因功能分析

5.4 小结

第六章 绵羊不同大小睾丸mRNA-miRNA-piRNA联合分析

6.1 材料与方法

6.1.1 试验设计

6.1.2 试验方法

6.2 试验结果和分析

6.2.1 TDETGs的获取

6.2.2 mRNA-miRNA调控网络的构建

6.2.3 miRNA-mRNA-piRNA调控关系构建

6.3 讨论

6.4 小结

第七章 湖羊睾丸大小性状GWAS研究

7.1 材料与方法

7.1.1 试验材料

7.1.2基因组DNA提取及检测

7.1.3 基因组重测序

7.1.4 测序数据统计及指控

7.1.5 比对参考基因组

7.1.6 变异检测与注释

7.1.7 GWAS分析

7.2 结果与分析

7.2.1 重测序测序结果

7.2.2 SNPs检测及注释结果

7.2.3 GWAS分析结果

7.3 讨论

7. 4小结

第八章 全文结论

参考文献

附录Ⅰ 文中相关的表格

附录Ⅱ 文中相关的图片

在读期间的研究成果

致谢