噬菌体辅助的蛋白-蛋白相互作用进化体系的构建与验证

摘要

特异性蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)是蛋白质的核心功能，通过定向进化改进PPI乃至获得新的PPI是蛋白质工程的重要目标。目前常规定向进化方法每一轮（即每一代）都需要人工筛选分离目的基因，然后构建突变体库，可完成的进化代数有限。噬菌体辅助的连续进化(PACE)系统(Esveltet al，Nature，472(7344)，499-503)在每轮进化间不需要人工干预，携带于噬菌体上的目的基因数分钟到数十分钟就可以进化一代，因此是一种十分有潜力的蛋白质工程新技术。理论上，PACE可广泛用于各种类型的蛋白质功能进化，但目前已报道的应用还限于RNA聚合酶等直接行使转录功能的蛋白。原理上PACE也可以应用于PPI的定向进化，其前提是将PPI强度转换为对M13噬菌体增殖能力的调控。本论文在PACE的整体框架下，通过细菌双杂交用PPI调控M13噬菌体增殖，从而完成了PACE应用于PPI所需的核心模块的构建和测试。PACE技术是一个相对复杂的系统，其完整实现需要多个模块协调配合。本论文还在自发致突变模块、连续流动筛选平台的搭建、调试方面开展了一系列工作，为今后完整实现基于PACE的PPI定向进化奠定了基础。论文各章内容简介如下。
　　第一章中，在对PPI和定向进化做简要综述后，我介绍了PACE系统的基本原理，着重讨论其相对于传统定向进化的优势。
　　第二章中，我报道了用PPI控制M13噬菌体增殖的细菌双杂交系统的具体实现和验证。该系统由改造后的噬菌体质粒和辅助质粒组成。其中，噬菌体质粒敲除了PⅢ蛋白编码器基因，引入了参与PPI的一个目的蛋白编码基因;辅助质粒含双杂交系统的其余部分，以及预期受PPI调控的噬菌体PⅢ蛋白基因。在这里，PⅢ基因上游启动子在有PPI和无PPI时各自的表达强度是系统的关键参数:如果启动子过强，可能在尚未被噬菌体侵染的细胞中引起PⅢ蛋白的泄漏表达，导致细菌对噬菌体侵染的抵抗;而如果启动子过弱，已被侵染的细胞中PⅢ蛋白表达不够，噬菌体也不能繁殖或繁殖很慢。我尝试将合成生物学标准元件库中的不同启动子元件用于我们的双杂交体系，找到了具有恰当强度的启动子。最后，我用ras-raf蛋白的相互作用，证明了改造后的噬菌体在目的PPI存在条件下可增殖，且PⅢ表达水平以及噬菌体的增殖速率都直接依赖于PPI强度。
　　将PACE技术完整迁移到本地需要一系列平台搭建、测试和调试工作，我在论文第三章中报道了在这方面工作中我所完成的部分。其一是对致突变质粒的鉴定改造。该质粒的功能是诱导表达致突变基因。前期我们从其他实验室获得了致突变质粒，但经鉴定发现其致突变效率尚达到不到预期。经分析这可能是其对诱导物（阿拉伯糖）响应存在缺陷造成的。我对致突变质粒进行了改造，使其对诱导物响应变得更灵敏。此外，我们还进行了PACE系统的联调，在此过程中发现细菌繁殖速率、噬菌体繁殖速率和系统置换速率之间的平衡是关键，且可行的参数窗口可能较窄，导致目前我们已尝试过的培养条件和置换速率均导致系统中噬菌体数的持续减少而不是维持。由于实际实验的时间周期长，成本高，为了更精准的定位实验参数，我构造了一个数学模型来模拟PACE过程，并编写了程序实现该模型的仿真，该模型可用于指导实验参数的选择。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 双杂交体系应用于蛋白-蛋白相互作用的研究

1．2 实验室常规定向进化

1．3 M13噬菌体辅助的连续定向进化

第二章 双杂交调控噬菌体增殖体系的构建与验证

2．1 实验设计与质粒图谱

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验材料，试剂与仪器

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 对辅助质粒的分子克隆改造结果

2．3．2 对M13噬菌体质粒的分子克隆改造结果

2．3．3 不同强度组成型启动子的选择

2．3．4 用荧光分光光度计检测PⅢ蛋白表达实验

2．3．5 用不连续侵染实验检测系统功能

2．3．6 讨论

第三章 PACE技术平台的搭建与调试

3．1 对致突变质粒的分子克隆改造及功能检验

3．1．1 实验设计与质粒图谱

3．1．2 实验材料与方法

3．1．3 实验结果与讨论

3．2 PACE系统的参数探索与选择

3．2．1 实验材料与方法

3．2．2 实验与数学建模的结果与讨论

参考文献

附录

致谢