基于电子顺磁共振方法的膜蛋白结构解析以及功能研究

摘要

通过位点特异性自旋标记电子顺磁共振方法能够获得生物大分子的动力学信息、易趋性信息和距离信息，近年来该方法已经被广泛的应用于生物大分子的结构功能研究中。在本论文中，我们使用电子顺磁共振方法对膜蛋白YgaP和IFITM3的结构功能进行研究，成功地解析了去污剂中全长YgaP膜蛋白的三维结构以及IFITM3蛋白的跨膜拓扑结构。论文由四个章节组成。
　　第一章简要介绍了电子顺磁共振的基本理论、电子顺磁共振中的各种相互作用力以及电子顺磁共振谱仪的组成。
　　第二章主要介绍电子顺磁共振方法在生物大分子中的应用。首先简要描述各种不同的自旋标记物和自旋标记方法。然后重点阐述位点特异性自旋标记电子顺磁共振技术的基本原理，并详细描述通过该方法得到蛋白质特定位点的动力学信息、易趋性信息以及位点之间的距离信息。最后还简要介绍了几个电子顺磁共振方法在膜蛋白以及核酸的结构功能研究中的实例。
　　在第三章中我们综合使用连续波电子顺磁共振、脉冲电子顺磁共振以及刚体计算方法成功地解析了全长YgaP膜蛋白的三维结构。具体的来说，首先通过系统的连续波电子顺磁共振分析得到YgaP蛋白跨膜结构域的动力学数据和易趋性数据，进而获得YgaP蛋白跨膜结构域的二级结构特征。然后使用连续波电子顺磁共振和双电子-电子共振方法测量得到YgaP蛋白跨膜结构域中的距离信息，并用于刚体结构计算中，获得YgaP跨膜结构域的三维结构。而后，我们还运用双电子-电子共振方法测量得到YgaP跨膜结构域与水溶性硫氰酸酶结构域之间的长程距离约束，并结合硫氰酸酶结构域的液体核磁共振结构，通过刚体计算方法得到全长YgaP膜蛋白的三维结构。此外，我们还对YgaP膜蛋白结合硫氰酸酶反应产物SCN-前后的动力学、易趋性和距离变化进行检测，结果发现YgaP蛋白结合底物SCN-后会发生构象变化，揭示了大肠杆菌细胞膜上的YgaP蛋白转运硫氰酸根离子的机制。
　　第四章中我们综合使用电子顺磁共振方法和核磁共振方法解析了IFITM3蛋白的跨膜结构域在去污剂DPC中的跨膜拓扑结构。连续波电子顺磁共振谱图分析和易趋性数据分析表明IFITM3蛋白的C末端存在一个长跨膜螺旋，N端疏水区域含有两个较短的膜内α螺旋，该结果证明IFITM3蛋白是一个Ⅱ型膜蛋白。我们还使用液体核磁共振方法对IFITM3蛋白的二级结构和主链弛豫进行分析，结果进一步证明IFITM3蛋白的Ⅱ型膜蛋白拓扑结构。该跨膜拓扑结构为IFITM3蛋白能够阻碍膜半融合的病毒抑制机理提供了结构基础。

目录

声明

摘要

第一章 电子顺磁共振的理论简介

1．1 引言

1．2 电子顺磁共振基本原理

1．3 电子顺磁共振中的各种相互作用

1．3．1 电子自旋Zeeman相互作用

1．3．2 核自旋Zeeman相互作用

1．3．3 超精细耦合

1．3．4 零场分裂

1．3．5 核四极矩

1．3．6 偶极-偶极相互作用

1．3．7 海森堡交换耦合

1．4 g因子

1．5 电子顺磁共振谱仪

参考文献

第二章 EPR在生物大分子中的应用

2．1 引言

2．2 生物大分子中的自旋标记

2．2．1 自旋标记物

2．2．2 位点特异性自旋标记方法(SDSL)

2．2．3 其他自旋标记方法

2．3 EPR在蛋白质研究中得到的主要信息

2．3．1 蛋白动力学信息

2．3．2 易趋性信息(Accessibility)

2．3．3 蛋白中的距离信息

2．4 EPR在生物大分子中的应用

2．4．1 蛋白质的结构功能研究

2．4．2 EPR在核酸研究中的应用

2．4．3 原位条件下的蛋白质EPR研究

2．5 小结

参考文献

第三章 基于电子顺磁共振方法的E．coli整合膜蛋白YgaP的结构解析和底物结合研究

3．1 引言

3．2 YgaP膜蛋白的背景介绍

3．2．1 硫氰酸酶简介

3．2．2 YgaP蛋白的结构和功能研究

3．2 实验材料与方法

3．2．1 YgaP膜蛋白的基因和氨基酸序列以及蛋白二级结构的预测

3．2．2 分子克隆以及位点特异性突变

3．2．3 YgaP膜蛋白的表达与纯化

3．2．4 YgaP膜蛋白的位点特异性自旋标记

3．2．5 圆二色光谱实验

3．2．6 连续波EPR实验以及数据处理

3．2．7 功率饱和EPR实验以及数据处理

3．2．8 CW-EPR方法和DEER方法的距离测量

3．2．9 EPR方法测量的距离约束的处理

3．2．10 YgaP膜蛋白的结构计算

3．2．11 YgaP结合SCN-的EPR检测

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 YgaP膜蛋白的表达和纯化

3．3．2 YgaP膜蛋白在DPC去污剂中的圆二色光谱结果与分析

3．3．3 单自旋标记YgaP膜蛋白的CW-EPR光谱以及动力学分析

3．3．4 单自旋标记YgaP膜蛋白的易趋性分析

3．3．5 CW-FPR方法和DEER方法的距离测量结果及分析

3．3．6 全长YgaP膜蛋白的结构解析

3．3．7 YgaP膜蛋白结合底物SCN-的动力学变化

3．3．8 YgaP膜蛋白结合底物SCN-的构象变化

3．4 本章小结

参考文献

第四章 利用电子顺磁共振方法研究人源干扰素诱导膜蛋白IFITM3的跨膜拓扑结构

4．1 背景介绍

4．1．1 干扰素刺激基因与病毒抑制因子

4．1．2 IFITM蛋白简介及其抗病毒功能

4．1．3 IFITM蛋白的翻译后修饰

4．1．4 IFITM蛋白的拓扑结构以及功能机制研究

4．2 实验材料与方法

4．2．1 IFITM3膜蛋白的基因和氨基酸序列

4．2．2 IFITM3膜蛋白的二级结构预测

4．2．3 位点特异性半胱氨酸突变

4．2．4 IFITM3膜蛋白的表达与纯化

4．2．5 IFITM3膜蛋白的位点特异性自旋标记

4．2．6 连续波EPR实验以及数据处理

4．2．7 功率饱和EPR实验以及数据处理

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 IFITM3膜蛋白的表达和纯化

4．3．2 自旋标记IFITM3膜蛋白的CW-EPR光谱以及分析

4．3．3 IFITM3蛋白的跨膜区氨基酸位点的易趋性分析

4．3．4 IFITM3蛋白的跨膜区(W60-Y132)在膜中的拓扑结构

4．4 本章小结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果