不同剂量丙戊酸钠对大鼠创伤性颅脑损伤脑组织ApoJ、AQP4、MMP-9蛋白表达影响的实验研究

摘要

目的：创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI)发病率较高，目前为止仍然具有较高的致残率和死亡率，对治疗颅脑损伤后继发性炎性改变、血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）破坏、脑水肿等继发性损伤的研究仍然停滞不前，导致致残率和死亡率无法得到进一步改善。因此，TBI后继发性损伤仍然是目前为止需遏待解决的难题。丙戊酸钠（valproic acid VPA）为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI），对多种癫痫发作均有效。最近研究表明，VPA在肿瘤抑制、双向情感障碍、偏头痛方面、失血性休克复苏和中枢神经系统疾病治疗中亦具有保护作用，特别是在TBI后神经保护应用方面显示出巨大前景，但目前其发挥在神经系统保护作用的剂量存在较大争论。本实验通过研究不同剂量丙戊酸钠（valproic acid VPA）对实验性大鼠创伤性颅脑损伤后的保护作用，探讨合适的给药剂量以及研究其相关保护机制。　　方法：1、取成年雄大鼠100只，采用控制性皮层撞击损伤（controlled cortical impact CCI）建立大鼠创伤性颅脑损伤模型，随机分成5组（n=20）。Sham组，TBI组，TBI+30mg VPA组，TBI+150mg VPA组，TBI+300mg VPA组。TBI+30mg VPA、TBI+150mg VPA、TBI+300mg VPA组分别于TBI造模清醒后每天行胃饲VPA30mg/kg、150mg/kg、300mg/kg，连续7天，Sham、TBI组给予胃饲等体积生理盐水。2、每一组20只大鼠分别按术后24h、3d、7d、14d时间点处死分成4个亚组，每组5只，分别行改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores，mNSS），并抽取颈内静脉血检测VPA血药浓度，处死断头取脑后于挫伤处脑组织行H-E染色观察脑挫伤灶和免疫组化法测水通道蛋白4（AQP4）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、载脂蛋白J（ApoJ），并行蛋白免疫印迹法（western-blot）测AQP4、MMP-9、ApoJ含量和采用干湿重法行脑组织含水测定。　　结果：1、与Sham组比较，伤后1、3、7、14天，TBI组mNSS评分均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），且伤后第1、3、7、14天后mNSS评分逐渐下降呈好转趋势；与TBI组相比，伤后第1、3、7、14天，TBI+150mg VPA组、TBI+300mg VPA组的mNSS评分均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），其中以TBI+300mg VPA组下降最明显；与TBI组相比，TBI+30mgVPA组的改良神经功能缺损评分变化无统计学意义；2、与Sham组比较，TBI组在伤后1、3、7天的脑组织含水量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），伤后第14天各组间脑组织含水量差异无统计学意义；与TBI组相比，伤后第1、3、7天，TBI+150VPA、TBI+300VPA组的脑组织含水量在明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），各组间比较，以TBI+300mg VPA组下降最明显；与TBI组相比，伤后14天，各给药组间，脑组织含水量差异无统计学意义（P＞0.05）；在伤后各时间点，TBI+30mg VPA组与TBI组相比脑组织含水量差异均无统计学意义（P＞0.05）；3、与Sham组比较，TBI组MMP-9表达在术后1d开始增加，3d达到峰值，7d、14d未见明显阳性表达；与TBI组相比较，TBI+VPA组在术后1、3天脑组织MMP-9表达均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），给药剂量越高，下降越明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在14d各给药组未见明显MMP-9阳性表达。4、与Sham组比较，TBI组AQP4表达在术后24h最高，3d开始下降，7d、14d回到基值；与TBI组相比较，TBI+VPA组在术后1、3d天脑组织AQP4表达均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），给药剂量越高，下降越明显，差异具有统计学意义（P＜0.05），术后7、14d天各组脑组织AQP4表达差异不具有具有统计学意义。5、与Sham组比较，TBI组ApoJ表达在1d开始增加，3d表达仍然较高，7d开始下降，14d回到正常；与TBI组相比较，TBI+VPA组在术后1、3d脑组织ApoJ表达均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），给药剂量越高，下降越明显，差异具有统计学意义（P＜0.05），术后第14d，各实验组间脑组织ApoJ表达无差异；　　结论：1、丙戊酸钠可以减轻脑损伤模型大鼠的脑水肿，保护神经元细胞，对大鼠脑损伤模型具有脑保护作用；2、丙戊酸钠可以抑制大鼠脑损伤模型脑组织中ApoJ、AQP4、MMP-9蛋白表达，在30mg/kg、150mg/kg、300mg/kg/d剂量研究中显示，剂量越大，其抑制作用越明显。3、VPA的脑保护作用可能是VPA抑制脑损害因子表达和抑制脑保护因子表达共同作用的结果。4、大剂量丙戊酸钠对大鼠脑损伤模型脑保护作用中更有优势，但应避免药物中毒反应。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1 实验动物

2 主要实验试剂

2.1主要实验试剂

2.2 分离胶、浓缩胶配置

2.3 主要工作液、缓冲液配置

3 主要实验仪器

4 实验方法

4.1 建立模型

4.2 取材

4.3 研究方法

5 血药浓度检测

6 统计学方法

结果

1 模型建立

1.1造模

1.2 死亡率

2 改良神经功能缺损评分

3 脑组织含水量测定

4 VPA血药浓度检测结果

5 western-blot检测结果

5.1 VPA降低了大鼠TBI后AQP4、MMP9表达

5.2 VPA降低了大鼠TBI后ApoJ表达

6H-E染色及免疫组化结果

6.1大体观察

6.2 H-E染色观察结果

6.3免疫组化结果显示VPA降低了大鼠TBI后AQP4、MMP-9、ApoJ表达

讨论

1 大鼠创伤性颅脑损伤模型的制作方法

2 VPA的给药剂量及方法

3 VPA减轻脑水肿，保护神经元，降低脑组织中AQP4、MMP-9蛋白表达，具有脑保护作用

4 VPA降低脑组织中ApoJ蛋白表达，VPA的脑保护作用可能是抑制脑损害因子和脑保护因子表达共同作用的结果

5、VPA的脑保护作用的剂量研究

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:丙戊酸钠神经保护保护作用机制

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