大肠埃希菌耐多药和耐消毒剂基因检测及遗传同源性分析

摘要

目的：了解本地区大肠埃希菌（Escherichia coli）耐多药情况、产超广谱β内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamase，ESBLs)基因及耐消毒剂基因的携带状况，分析基因与耐药表型之间的关系；应用ERIC-PCR对大肠埃希菌进行遗传同源性统计分析。　　方法：1.药敏实验：采用纸片扩散法测定本地区138株大肠埃希菌临床菌株对17种常见抗菌药物的耐药性，参照临床和实验室标准协会（CLSI)标准判定耐药情况，并筛选得到ESBLs菌株进行判定。2.PCR扩增检测及测序：通过PCR扩增检测产超广谱β内酰胺酶基因CTX-M、TEM、SHV及耐消毒剂基因qacEΔ1、qacE，并将PCR阳性反应产物送擎科生物科技有限公司测序。3.ERIC-PCR基因分型：应用该方法扩增各大肠埃希菌基因组DNA，检测其可扩增出的条带类型，采用SPSS22.0软件进行遗传同源性聚类分析。　　结果：1.药敏检测结果：1.1138株大肠埃希菌临床分离株对四类17种抗菌药物耐药情况：耐复方新诺明97株（70.29%）、耐萘啶酸115株（83.33%）、耐诺氟沙星77株（55.80%）、耐环丙沙星77株（55.80%）、耐左氧氟沙星54株（39.13%）、耐头孢西丁4株（2.90%）、耐头孢呋辛94株(68.12%)、耐头孢他啶23株（16.67%）、耐头孢噻肟55株（39.86%）、耐头孢曲松64株(46.38%)、耐哌拉西林85株（61.60%）、耐哌拉西林/他唑巴坦5株（0.72%）、耐氨曲南39株（28.26%）、耐链霉素87株（63.04%）、耐庆大霉素64株（46.38%）、耐阿米卡星5株（3.62%）、亚胺培南全部敏感。1.2耐药模式分布情况：耐多药菌株98株（71.01%），双耐药菌株27株（19.57%），单耐药6株（4.35%），全敏感菌株7株（5.07%）。1.3产ESBLs菌株检出情况：138株临床分离的大肠埃希菌中共检出ESBLs阳性菌株86株（62.31%）。产ESBLs菌株在不同耐药模式分布：多耐药模式77株（89.53%），双耐药模式9株（10.47%），在单耐药、全敏模式菌株中未检出ESBLs阳性菌株。经χ2检验比较ESBLs阳性菌株与ESBLs阴性菌株对复方新诺明、萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南、头孢呋辛、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、哌拉西林、链霉素、庆大霉素的耐药性，耐药性具有显著差异。2.耐药酶与耐消毒剂基因检测结果：2.1CTX-M、TEM、SHV型ESBLs耐药基因检测结果：138株E.coli临床分离株中，94株（68.12%）带有blaTEM基因，79株（57.25%）带有blaCTX-M基因，1株（0.72%）带有blaSHV基因。耐多药E.coli菌株中检出blaCTX-M阳性菌株70株（71.43%），blaTEM阳性菌株70株（71.43%），blaCTX-M+blaTEM阳性菌株48株（48.98%），通过χ2检验比较不同耐药类型菌株中blaCTX-M、blaTEM、blaCTX-M+blaTEM检出率，三种基因检出率存在显著差异。2.2耐消毒剂基因检出情况：138株大肠埃希菌临床分离株中检出qacEΔ1阳性菌株71株（51.45%），均未检测出qacE基因。qacEΔ1阳性菌株与qacEΔ1阴性菌株对复方新诺明、萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢呋辛、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、庆大霉素的耐药性比较，耐药性具有显著差异。在耐多药E.coli菌株中检出qacEΔ1阳性菌株63株（88.73%），非耐多药菌株检出qacEΔ1阳性菌株8株（11.27%），通过χ2检验比较耐多药菌株及非耐多药菌株耐消毒剂基因qacEΔ1检出率，在两种耐药类型的大肠杆菌中耐消毒剂基因qacEΔ1的检出率存在显著性差异。3.ERIC-PCR结果：ERIC-PCR指纹图谱扩增条带数2～7条，产物分布在100bp-2500bp;分为63个谱型。以80%的遗传相似性划分，聚类分析得出的结果43个类型，常见类型有三个(E23、E24和E27)。E23包括耐多药菌株7株，双耐药菌株3株；ESBLs表型阳性菌株5株；产CTX-M型ESBLs菌株5株；产TEM型ESBLs菌株8株；产耐消毒剂基因qacEΔ1菌株5株；源自泌尿系感染菌株4株，血流感染1株，呼吸系统1株，其他感染类型4株；源自内科3株，外科5株，妇产科1株，儿科1株。E24包括耐多药菌株11株，双耐药菌株1株；ESBLs表型阳性菌株7株；产CTX-M型ESBLs菌株6株；产TEM型ESBLs菌株8株；产耐消毒剂基因qacEΔ1菌株8株；源自泌尿系感染菌株4株，血流感染2株，其他感染类型6株；源自内科4株，外科6株，妇产科2株，儿科0株。E27包括多耐药菌株7株，双耐药菌株2株，单耐药菌株1株；ESBLs表型阳性菌株7株；产CTX-M型ESBLs基因7株；产TEM型ESBLs基因6株；耐消毒剂基因qacEΔ1基因5株；源自泌尿系感染菌株2株，血流感染2株，呼吸系统2株，其他感染类型4株；源自内科4株，外科6株，妇产科0株，儿科0株。　　结论：1.本地区E.coli均表现出对常用抗菌药物一定程度的耐药，且以耐多药模式常见；但对阿米卡星、β内酰胺类抗菌药物+酶抑制剂、头酶素类及碳青霉烯类抗菌药物的敏感性较高。2.ESBLs耐药基因以blaCTX-M、blaTEM型为主，耐多药菌株中blaCTX-M+blaTEM复合存在现象常见。3.耐消毒剂基因qacEΔ1检出率高，以耐多药菌株多见。4.同一类型菌株的耐药性、基因携带情况、感染类型及科室分布情况经遗传同源性分析，未发现存在明显聚集现象。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1实验菌株

1.2主要实验试剂和实验仪器

2.1制备培养基

2.2 细菌培养

2.3 药物敏感实验

2.4 PCR反应

结果

1 药敏检测结果

1.1药敏结果

1.2 ESBLs阳性菌株耐药情况

1.3 耐多药菌株耐药情况分析

2 耐药酶与耐消毒剂基因检测结果

2.1 CTX-M、TEM、SHV型ESBLs耐药基因检测结果

3.大肠埃希菌耐消毒剂基因qacEΔ1,qacE 基因检出情况

3 ERIC-PCR 结果

3.1 ERIC-PCR电泳结果

3.2 ERIC-PCR指纹图谱类聚分析类型之间耐药情况分析

4测序结果

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:ERIC-PCR研究进展

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