3D打印制备PLGA/ACECM组织工程软骨支架修复兔软骨缺损的实验研究

摘要

目的：关节软骨由于其特殊的组织结构，损伤后难以自我修复，如何实现关节软骨的再生是医学界及科学界所面临的巨大挑战。本课题的研究目的：1.采用低温沉积3D打印技术、改良式物理、化学脱细胞方法、冷冻干燥和物理化学法交联技术成功制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)支架、脱细胞软骨细胞外基质（articular cartilage extracellular matrix，ACECM）支架及PLGA/ACECM支架等三种组织工程软骨支架，探讨其理化学特性;2.构建兔体内膝关节软骨缺损模型，将三种软骨组织工程支架分别原位植入，观察支架对软骨再生的影响。　　方法：1.利用低温沉积3D打印技术制备PLGA支架，采用改良式物理、化学脱细胞方法制备ACECM浆料。利用冷冻干燥和物理化学法交联技术，制备ACECM支架，同法将ACECM浆料与PLGA支架复合制备PLGA/ACECM支架。2.体外评价3种支架的理化性质：支架的宏观结构采用一般观察方法，支架的微观结构采用扫描电镜（SEM）观察；利用组织学及免疫组化染色定性分析ACECM中所保留成分；支架的压缩模量利用生物力学机检测；支架的免疫排斥反应采用SD大鼠皮下包埋实验进行评估；L-929细胞复合三种支架浸提液进行培养，利用CCK-8细胞增殖分析试剂盒(cell countingkit8，CCK-8)检测细胞增殖情况；将第二代兔软骨细胞分别种植于三种支架上，通过扫描电镜及死活细胞染色观察软骨细胞的生长情况。3.构建兔体内膝关节软骨缺损模型，将三种软骨组织工程支架分别原位植入，分别于术后3月、6月时间点处死动物取材，通过大体观、影像学检查（X-RAY、Micro-CT、MRI）、组织学染色评价软骨再生的情况。　　结果：1.大体观和SEM观察三种支架均具有垂直三维取向的多孔隙结构；组织学及免疫组化定性分析证明ACECM脱细胞完全，保留了软骨细胞外基质的糖胺聚糖(glycosaminoglycans GAGs)和Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen)成分；生物力学测试表明，PLGA支架的压缩模量与PLGA/ACECM支架没有显著差异，PLGA支架和PLGA/ACECM支架的压缩模量显著高于ACECM支架，差异有统计学意义，PLGA支架与PLGA/ACECM支架相比ACECM支架具有更好的生物力学特性；三种支架SD大鼠皮下包埋均未见明显的排斥反应，HE染色显示，ACECM支架、PLGA/ACECM支架免疫排斥反应明显较PLGA支架低；CCK-8测定结果表明，随着细胞在支架浸提液中生长时间的延长，细胞数量呈现逐渐递增的趋势，差异与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）；扫描电子显微镜和死活细胞染色显示软骨细胞在三种支架上均可以生长。2.动物实验可见空白对照组关节软骨缺损修复区仅有少量组织填充，PLGA支架组的关节软骨缺损区域观察到部分组织生长，ACECM支架组软骨缺损修复区域大部分填充，与周围正常软骨界面交界线部分可见，修复缺损的中央部分组织缺失，PLGA/ACECM支架组软骨缺损区域完全填充，外观上接近正常软骨组织，新生软骨与周围正常软骨界面交界线变得模糊，修复区软骨连续、平整。组织学染色及影像学检查（X-RAY、Micro-CT、MRI）显示PLGA/ACECM支架组修复兔膝关节软骨缺损的能力高于空白对照组、PLGA支架组和ACECM支架组。　　结论：软骨仿生性PLGA/ACECM支架具有良好的三维取向多孔隙结构，相对于单纯PLGA支架和ACECM支架具有良好的生物学与力学特性。兔膝关节内支架植入实验结果显示，软骨仿生性PLGA/ACECM支架可以实现软骨的完全再生，阻止骨关节炎的发生，是一种良好的组织工程软骨支架材料。

目录

前言

目的

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

结果

1.三种支架的大体观及微观结构

2.ACECM支架的组织学及免疫组织化学染色分析

3.三种支架的力学性能检测

4.三种支架SD大鼠皮下包埋的免疫排斥分析

5.支架细胞毒性的体外评估

6.三种支架的细胞相容性研究

讨论

结论

附图

实验二 三种支架修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

前言

目的

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

结果

1.实验动物取材情况的大体观

2.关节软骨再生区域的大体观

3.动物实验影像学检查结果

4.动物取材的组织学分析

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

英汉缩略词对照表

综述:软骨再生3D生物打印的最新进展及展望

参考文献

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