祛风通窍方对血管性痴呆模型大鼠作用机制的研究

摘要

目的：　　通过观察祛风通窍方对血管性痴呆（VD）大鼠定位航行、空间探索能力，海马CA1区神经元细胞形态，ChAT、Tau、Aβ、VEGF蛋白表达，IL-1β、IL-6、TNF-α浓度的影响，探讨祛风通窍方对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力的保护作用机制。　　方法：　　1.分组：水迷宫筛选符合实验要求大鼠，随机分为假手术组、尼莫地平组、模型组、祛风通窍方高、中、低剂量组，每组大鼠各10只。　　2.给药方法：高、中、低剂量组分别给予祛风通窍方26.8g/kg/d、13.4g/kg/d、6.7g/kg/d灌胃（按照等体积3ml的标准计算高、中、低剂量组大鼠灌胃药物的浓度）。模型组、假手术组予以3ml生理盐水灌胃。尼莫地平组予以尼莫地平混悬液6.25mg/kg/d灌胃。每天上午灌胃一次，连续30天。　　3.取材方法：配置戊巴比妥钠浓度1％，对实验大鼠进行腹腔麻醉。大鼠仰卧位固定于消毒实验台，开胸取血，离心,取上清液，-20℃冰箱保存，用于ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度。采集血液后，一部分大鼠迅速断头取出新鲜脑组织，将脑组织置于EP管中保存，用于半定量PCR及Western Blot检测VEGF蛋白。另一部分大鼠进行灌注取脑，用于HE染色和免疫组化检测ChAT、Tau、Aβ蛋白。　　4.观察指标：Morris水迷宫检测大鼠定位航行、空间探索能力；HE染色光镜观察大鼠海马CA1区神经元细胞形态；免疫组化检测ChAT、Tau、Aβ蛋白表达；ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α浓度；半定量PCR法测定VEGFmRNA表达；Western Blot法检测VEGF蛋白表达。　　结果：　　1.行为学：与假手术组比较，高、中、低剂量组、模型组、尼莫地平组大鼠EL延长，第I象限游泳的时间缩短，经过原平台范围的次数减少，差异具有统计学意义（P<0.05），高剂量组大鼠EL随着训练时间延长而缩短，从第四天开始接近于假手术组。与模型组比较，高、中、低剂量组、尼莫地平组大鼠的EL随着训练时间延长而缩短，第I象限游泳的时间延长，经过原平台范围的次数增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。与尼莫地平组比较，低剂量组EL随着训练时间延长而缩短，第I象限游泳的时间延长，经过原平台范围的次数增加，但差异无统计学意义（P>0.05）；高、中剂量组大鼠EL随着训练时间延长而缩短，第I象限游泳的时间延长，经过原平台范围的次数增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。其中，以高剂量组大鼠行为学改善更为明显，与中剂量组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。　　2.HE染色：同倍率光镜下观察,假手术组海马CA1区神经元细胞排列整齐，胞质均质红染，胞核大而圆，核仁清晰明显。模型组海马CA1区神经细胞排列紊乱，数量减少，细胞轮廓、胞核模糊，部分甚至看不到细胞。高、中剂量组神经细胞排列比较规则，细胞轮廓、核膜与核仁比较清晰，且高剂量组神经细胞形态优于中剂量组，更为接近正常形态。低剂量组和尼莫地平组的神经元细胞形态介于模型组与中剂量组之间。　　3.ChAT、Tau、Aβ蛋白检测：ChAT、Tau、Aβ阳性细胞均表现为胞浆内呈现棕黄色的沉淀物。　　①ChAT蛋白：与假手术组比较，模型组、各给药组ChAT蛋白MOD值有所降低（P<0.05）。与模型组比较，各给药组ChAT蛋白MOD值有所升高（P<0.05）。与尼莫地平组比较，低剂量组ChAT蛋白MOD值升高，但差异无统计学意义（P>0.05)；高、中剂量组ChAT蛋白MOD值有所升高，差异有统计学意义（P<0.05）。其中，以高剂量组升高最为明显，与中剂量比较，差异有统计学意义（P<0.05）。　　②Tau蛋白：与假手术组比较，模型组、各给药组Tau蛋白MOD值有所升高（P<0.05）。与模型组比较，各给药组Tau蛋白MOD值降低（P<0.05）。与尼莫地平组比较，低剂量组Tau蛋白MOD值降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；高、中剂量组Tau蛋白MOD值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。其中，以高剂量组降低最为明显，与中剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。　　③Aβ蛋白：与假手术组比较，模型组、各给药组Aβ蛋白MOD值有所升高（P<0.05）。与模型组比较，各给药组Aβ蛋白MOD值有所降低（P<0.05）。与尼莫地平组比较，低剂量组Aβ蛋白MOD值降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；高、中剂量组Aβ蛋白MOD值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。其中，以高剂量组降低最为明显，与中剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。　　4.IL-6、IL-1β、TNF-α检测：与假手术组比较，模型组、各给药组IL-6、IL-1β、TNF-α浓度有所升高（P<0.05）。与模型组比较，各给药组IL-6、IL-1β、TNF-α浓度降低（P<0.05）。与尼莫地平组比较，高、中、低剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α浓度有所降低（P<0.05）。其中，以高剂量组降低最为明显，与中剂量组比较，差异具有统计学意义。　　5.VEGFmRNA表达检测：与假手术组相比，模型组、各给药组VEGFmRNA表达有所增加（P<0.05）。与模型组比较，各给药组VEGFmRNA表达有所增加（P<0.05）。与尼莫地平组比较，低剂量组VEGFmRNA表达增加，但差异无统计学意义（P>0.05）；高、中剂量组VEGFmRNA表达有所增加，差异有统计学意义（P<0.05）。其中，以高剂量组增加最为明显，与中剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。　　6.VEGF蛋白表达检测：与假手术组相比，模型组、各给药组VEGF蛋白表达有所增加（P<0.05）。与模型组比较，各给药组VEGF蛋白表达有所增加（P<0.05）。与尼莫地平组比较，低剂量组VEGF蛋白表达增加，但差异无统计学意义（P>0.05）；高、中剂量组VEGF蛋白表达有所增加，差异有统计学意义（P<0.05）。其中，以高剂量组增加最为明显，与中剂量组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。　　结论：　　1.血管性痴呆大鼠存在学习记忆能力的下降；海马CA1区神经元细胞形态紊乱，ChAT蛋白表达降低,Tau、Aβ蛋白表达升高，IL-6、IL-1β、TNF-α的浓度升高，VEGF表达增加。　　2．祛风通窍方能有效改善VD大鼠的行为学，保护VD大鼠海马CA1区神经元细胞形态。　　3．祛风通窍方对血管性痴呆模型大鼠的作用机制可能与以下有关：　　①上调VD大鼠ChAT的表达，改善胆碱能系统的功能；　　②抑制VD大鼠脑内Tau蛋白过度磷酸化，降低Aβ蛋白表达，减少神经元的损害；　　③降低VD大鼠血清中炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的浓度，从而抑制VD大鼠缺血区的炎性反应；　　④能刺激VEGF的表达，从而促进缺血时血管的新生,修复缺血损伤的神经。　　4.祛风通窍方改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力存在一定量效关系。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要实验实剂

3 主要实验仪器

4 主要溶液配制

5 实验方法

6 标本制作

7指标检测

8 实验流程

9 数据整理及统计学分析

结果

1 动物死亡情况分析

2 大鼠行为学变化

3 HE染色光镜观察大鼠海马 CA1 区神经元细胞形态

4 免疫组化检测检测ChAT、Tau、Aβ蛋白

5 ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α

6 半定量PCR法测定VEGF蛋白

7 Western Blot 法检测VEGF蛋白

讨论

1 课题选择及设计依据

2 祛风通窍方对大鼠行为学的影响分析

3 祛风通窍方改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力的机制分析

4 总结与展望

结论

参考文献

致谢

综述：血管性痴呆的中西医研究进展

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