СПОСІБ ДОСЛІДЖЕННЯ ХОНДРОГЕННОЇ АКТИВНОСТІ ЗБАГАЧЕНОЇ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМИ (ЗТП) З ВИКОРИСТАННЯМ КУЛЬТУРИ ХОНДРОЦИТІВ ЩУРА

摘要

Спосіб дослідження хондрогенної активності збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) з використанням культури хондроцитів щура є методом діагностики. Спочатку отримують ЗТП щурів - кров тварин збирають після декапітації і стабілізують гепарином, для виділення та концентрування ЗТП негайно після забору крові її центрифугують в два етапи: 10 хв при 2000 об/хв з використанням центрифуги ОПН-8 ("Дастан") та 5 хв при 3000 об/хв, підрахунок чисельності та життєздатності отриманих тромбоцитів проводять в камері Горяєва після попереднього забарвлення 0,2 % розчином трипанового синього ("Sigma") із допомогою світлового мікроскопа Микмед-5. Далі отримують суспензію хондробластів пульпозного ядра - хвостовий відділ хребта дорослого щура звільняють від шкіри та оболонок, в стерильних умовах промивають фізіологічним розчином та виділяють зону пульпозного ядра з міжхребцевих дисків. Отриману тканину суспендують в поживному середовищі Ігла ("РАА"), з додаванням 10 % сироватки великої рогатої худоби (ВРХ) ("РАА") та проводять підрахунок чисельності та життєздатності отриманих тромбоцитів в камері Горяєва після попереднього забарвлення 0,2 % розчином трипанового синього ("Sigma") із допомогою світлового мікроскопа Микмед-5. Далі проводять культивування клітин - культивування хондробластів проводять у відповідності з методом С Lööv, який є моделлю травматичного ураження в умовах in vitro. Отриману суспензію хондробластів висівають у чашці Петрі, додають поживну суміш, яка складається з середовища Ігла ("РАА"), з додаванням 10 % сироватки ВРХ ("РАА") та культивують у СO2-інкубаторі при 37 °C та 5 % СO2 протягом 3 діб, до експериментальних зразків додають свіжоотриману ЗТП в концентрації 30 % по відношенню до чисельності клітин. По закінченні цього терміну проводять аналіз життєздатності клітин, як згадувалося вище, та кріоконсервацію зразків для подальших молекулярно-генетичних досліджень. Далі проводять визначення експресії генів - експресію генів колагену II (соl II), агрекану (aсan), олігомерного матриксного протешу хряща (сomp), гліпікану (gpc3), анексину (anх3), плеотрофіну (ptn), матриксного протеїну gla (mgp) та віментину (vim) в культурі клітин ПЯ хвостових хребців щурів визначають методом ПЛР зі зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР).