人神经干细胞体外诱导过程中信号分子调控及移植后不同内环境下命运研究

摘要

由于神经细胞损伤或死亡导致的神经退行性疾病如脑卒中，帕金森等已经成为目前严重危害人们健康的主要疾病类型。然而，由于神经系统自我修复能力有限，该类疾病尚缺乏有效的治疗措施及手段。神经干细胞具有分化为神经系统内各种细胞的能力，通过于细胞移植等再生医学手段为神经系统疾病的治疗带来巨大希望。人多能干细胞(hPSCs)如胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)不但具有无限的自我更新能力，而且能够在体外分化为各种细胞类型，为体外稳定获得具有移植功能的神经干细胞提供了很好的来源。然而就目前来说，由于神经发育过程中的分子调控机制，尤其是人神经发生机制还不清楚，利用hPSCs体外分化获得有功能的神经干细胞还存在很多问题需要解决，如分化效率不稳定，神经干细胞群体不均一，体外自我更新能力弱等。另外，体外分化的神经干细胞移植体内后在不同内环境下的命运决定，如存活，分化，归巢等尚不明确。基于此，在本论文中，我们在优化人神经干细胞分化方法的基础上，详细研究了人多能干细胞神经分化过程中不同胞外信号分子的调控作用及机制，为体外获得不同类型的神经干细胞提供了理论基础;并进一步通过移植和观察不同体内环境下神经干细胞的命运变化，为将来针对不同类型疾病选择合适的移植途径和细胞类型奠定了基础。
　　为获得具有较强自我更新能力，群体均一的特定类型神经干细胞，我们在优化利用SMAD双抑制促使人多能干细胞分化为神经干细胞的基础上，详细探讨分化过程中不同信号分子如GSK3，ERK等对于神经干细胞不同命运决定的影响及作用机制。首先，我们确认了传统的SMAD双抑制方法(S/D)通过上调转录因子OTX2，进而诱导PAX6的表达，最终诱导产生前脑神经前体细胞;在SMAD双抑制基础上抑制GSK3通路(S/D/C)激活决定后脑发生的转录因子GBX2表达，GBX2拮抗OTX2进而阻遏PAX6的表达上调，最终诱导产生的后脑神经前体细胞相较前脑神经前体细胞具有增殖能力强，分化谱系更广的特点。
　　体外诱导的前脑前体细胞和后脑前体细胞分别移植到新生三天大鼠侧脑室，两周和四周后检测发现，后脑前体细胞的体内存活率高于前脑前体细胞，两种细胞的迁移方向和分化情况没有明显区别。另外，在诱导神经干细胞的体内移植研究中我们发现，移植细胞在新生和成体脑内的迁移方向和部位均与成体神经发生部位一致，移植细胞在新生鼠脑内沿白质区向嗅球和小脑位置迁移，而成体鼠脑内移植细胞倾向整合到成体神经干细胞的聚集区海马区，说明移植到体内的神经干细胞能正常按照成体神经发生的路径和部位进行迁移整合。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 人多能干细胞的研究背景

1．2．1 胚胎干细胞的发现及分离

1．2．2 干细胞的人工诱导即细胞重编程

1．3 干细胞应用研究

1．3．1 人多能干细胞的I临床移植应用现状

1．3．2 基于干细胞分化的细胞疾病模型

1．3．3 iPSC对神经系统疾病和损伤的应用重要性

1．4 胚胎神经发育和干细胞神经分化过程调控机制

1．4．1 胚胎神经系统发生过程

1．4．2 神经系统发生调控机制

1．5 人神经细胞体外诱导方法研究

1．5．1 EB法诱导人神经干细胞

1．5．2 单层法诱导人神经干细胞

1．5．3 转分化诱导人神经干细胞或神经前体细胞

1．5．4 其他神经细胞定向诱导

第二章 人多能干细胞的神经分化过程中GSK3与ERK通路的调控初步研究

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 细胞

2．3 方法

2．3．1 无饲养层(Feeder-free)人多能干细胞培养

2．3．2 人神经干细胞诱导

2．3．3 实时荧光定量PCR

2．3．4 细胞流式检测

2．4 结果

2．4．1 人多能干细胞体外神经诱导方法的建立

2．4．2 GSK3和ERK通路的抑制影响PAX6的表达

2．4．3 GSK3与ERK抑制后诱导细胞增殖能力差别明显

2．5 讨论

2．6 结论

第三章 GSK3通路在人多能干细胞神经分区分化中的调控作用研究

3．1 引言

3．2 材料

3．3 方法

3．3．1 人神经干细胞单层诱导

3．3．3 蛋白印迹反应和磷酸化蛋白印迹反应

3．3．4 神经干细胞成球实验和神经干细胞扩增培养

3．3．5 细胞周期检测

3．3．6 BrdU检测细胞增殖比率

3．3．7 神经干细胞的神经元分化

3．3．8 神经元电生理检测

3．3．10 病毒包装感染

3．3．11 基因knock down细胞系的建立

3．4 结果

3．4．1 GSK3的抑制阻遏PAX6表达但不影响干细胞的神经分化

3．4．2 S／D／C-NPC具有强的自我更新能力及较高的神经胶质细胞分化效率

3．4．3 S／D／C-NPC表现出后脑神经前体细胞特征

3．4．4 S／D／C-NPC与S／D-NPC具有不同的亚型神经细胞分化倾向

3．4．5 人神经干细胞分区分化的分子机制

3．5 结论

第四章 诱导人神经干细胞的体内移植研究

4．1 引言

4．2 材料

4．3 方法

4．4 结果

4．4．1 人神经干细胞移植新生鼠正常存活分化迁移

4．4．2 人神经干细胞移植成体大鼠侧脑室后整合至海马区

4．5 讨论

4．6 结论

结语

参考文献

附录

致谢

研究生在读期间成果