奥曲肽对人肝星状细胞增殖、凋亡及STAT3、P-STAT3、SOCS3表达的影响

摘要

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是由多种慢性持续性肝脏损伤后引起的组织代偿修复反应，是发展为肝硬化的必经阶段。大量研究表明，肝纤维化在去除相关损害因素后是一可逆的病理过程[1]。肝星状细胞是合成细胞外基质的主要细胞，是肝纤维化发生发展过程的关键细胞。Janus kinase/signal transducer and activator of transcription-3(JAK/STAT3)信号通路具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，SOCS3是JAK/STAT3信号通路的负调控因子，共同参与人类恶性增殖性疾病的发生、发展。本实验前期研究发现，生长抑素衍生物奥曲肽能显著抑制人肝星状细胞增殖、并促进其凋亡，从而抑制肝纤维化进展。奥曲肽抑制人肝纤维化作用是否与JAK/STAT3信号通路及其负调控因子SOCS3有关目前尚无相关文献报道。　　第一部分奥曲肽对人肝星状细胞增殖及凋亡的影响　　目的:研究奥曲肽(octreotide，OCT)对人肝星状细胞增殖、凋亡的影响。　　方法:体外培养人肝星状细胞系LX-2，采用免疫细胞化学法（PV法）检测α-SMA蛋白，Desmin蛋白的表达以进行活化人肝星状细胞鉴定。使用不同浓度的奥曲肽（10-3、10-4、10-5、10-6mmol/L）持续干预24h、48h、72h后，采用MTT法检测奥曲肽对LX-2细胞增殖的影响，采用TUNEL荧光法检测LX-2细胞凋亡情况，并绘制凋亡曲线。　　结果:(1)免疫细胞化学法测得LX-2可表达α-SMA，Desmin蛋白，且表达部位均为胞浆。(2) MTT结果显示:奥曲肽成时间依赖性及浓度依赖性抑制LX-2的增殖，其中，72h10-3mmol/LOCT组对LX-2细胞增殖的抑制作用最明显。(3) TUNEL荧光法检测奥曲肽对LX-2细胞凋亡的影响，结果表明，24h、48h不同浓度OCT组LX-2细胞凋亡率均高于相应时间点对照组。高浓度OCT组促凋亡作用明显强于低浓度组，48h OCT组促凋亡作用明显强于24hOCT组。　　结论:(1)体外培养的LX-2为活化人肝星状细胞。(2)奥曲肽具有抑制LX-2增殖和促进其凋亡的作用，并且，该作用具有时间及浓度依赖性。　　第二部分奥曲肽对人肝星状细胞STAT3、p-STAT3、SOCS3表达的影响　　目的:研究奥曲肽对人肝星状细胞STAT3、p-STAT3、SOCS3表达的影响，进一步阐明OCT发挥抗肝纤维化作用可能的调控机制。　　方法:RT-PCR检测STAT3 mRNA和SOCS3 mRNA盼表达情况，免疫细胞化学法(PV法)和Western-blot法检测STAT3、p-STAT3及SOCS3蛋白的表达。　　结果:(1)免疫细胞化学法检测STAT3和SOCS3蛋白表达情况，奥曲肽干预LX-224h、48h、72h后，OCT组STAT3与SOCS3蛋白表达量均低于相应时间点对照组。相同干预时间，随奥曲肽浓度增加STAT3的表达量逐渐增加，SOCS3于10-4或10-5mmol/L浓度时表达最多，各组间差异具有统计学意义（P均＜0.05);同一药物浓度，随干预时间增加，STAT3的表达量无明显变化(P＞0.05)，SOCS3的表达量逐渐减少，差异具有统计学差异(P＜0.05)。(2) RT-PCR法测STAT3 mRNA和SOCS3 mRNA结果显示:同一时间点，STAT3 mRNA的表达量随药物浓度增加而逐渐增加，且各OCT组STAT3 mRNA的表达量均低于相应时间点对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05);同一浓度不同时间点STAT3 mRNA表达量无明显差异(P＞0.05)。同一时间点，不同浓度OCT组SOCS3mRNA的表达量均低于相应对照组，其中，10-4mmol/L OCT组SOCS3mRNA表达量最多，差异具有统计学意义(P＜0.05);同一药物浓度，SOCS3 mRNA的表达随药物作用时间延长而减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。(3) Western-blot法结果显示，奥曲肽分别干预LX-224h、48h、72h后，与相应时间点对照组比较，OCT组p-STAT3蛋白、SOCS3蛋白的表达量均明显减少，差异具有统计学意义（P均＜0.05）。说明奥曲肽能明显抑制LX-2 STAT3蛋白的表达，同时JAK/STAT3信号通路的负调控因子SOCS3参与其中，共同抑制肝纤维化过程。　　结论:(1)奥曲肽在mRNA及蛋白水平显著下调人肝星状细胞STAT3、p-STAT3、SOCS3的表达。(2) JAK/STAT3信号通路及其负调控因子SOCS3可能是奥曲肽抑制LX-2增殖并促进其凋亡的机制之一，奥曲肽可能是通过降低STAT3表达从而抑制肝纤维化的发生和发展。

目录

摘要

前言

第一部分 奥曲肽对人肝星状细胞增殖及凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 奥曲肽对人肝星状细胞STAT3、p-STAT3、SOCS3表达的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

STATs与肝纤维化关系的研究进展 综述

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