低氧培养的骨髓间充质干细胞对小鼠放射性肺损伤的治疗作用及机制研究

摘要

背景:　　放射性肺损伤（Radiation-induced lung injury,RILI）是核战争、核与放射事故、核恐怖袭击等大剂量受照人员最常见的也是最严重的放射损伤之一，是导致放射损伤伤员死亡的重要因素。此外，RILI还是胸部肿瘤患者放射治疗后常见的并发症，胸部肿瘤放疗时有14.6％-37.2％患者伴有放射性肺损伤发生，这严重限制了肿瘤的治疗效果，也影响了患者的生活质量。然而，目前临床上对RILI的治疗尚无十分有效的方法和措施，因此，寻找有效治疗RILI药物或手段，不论在军事医学领域还是肿瘤放疗方面均具有非常重要的意义和应用前景。　　放射性肺损伤包括急性期的放射性肺炎和慢性期的放射性肺纤维化两个阶段。RILI发生机制目前主要有以下几种学说:靶细胞学说、细胞因子学说，以及上皮细胞间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)学说。根据RILI的发生机制，现在临床上的治疗药物主要包括:针对减轻炎症的糖皮质激素，清除氧化自由基的抗氧化类药物以及细胞因子抑制剂等。这些药物在放射性肺损伤的治疗中发挥了积极的作用，但由于RILI发生机制复杂，影响因素多，目前的治疗药物难以针对发病机制中的各个环节发挥作用，因此还不能达到理想的治疗效果。　　近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的研究为RILI的治疗提供了新的思路和策略。MSCs是具有高度自我更新、多向分化潜能的多能干细胞，又因其免疫原性低、易获得和便于体外扩增的特点，受到广泛的关注，在多种疾病中均显示了其较好的治疗效果，如心衰、肝损伤、皮肤损伤等。在放射性肺损伤治疗应用中，也有一些研究进行了有益的尝试，取得了一定的治疗效果。由于RILI不同于其它因素造成的组织损伤，电离辐射通过产生大量自由基导致的组织损伤环境以及局部的肺组织缺血缺氧的条件，严重限制了外源性MSCs的归巢以及在受损组织的停留，致使其发挥作用时间短，治疗效果欠佳，尤其是对后期的肺纤维化则无明显改善作用。近年来一些研究发现低氧条件下，MSCs的增殖能力、分化能力明显加强，许多生长因子表达大量上调。特别是发现低氧影响细胞最显著的效应分子——乏氧诱导因子（HIF-1α)不仅能够促进胞增殖，增强细胞活力，还能增强对细胞辐射耐受作用。因此推测，低氧培养的MSCs有可能更好耐受局部缺血缺氧的环境，使更多的MSCs进入损伤的肺组织并长期存活，高增殖、多分化，从而对RILI发挥更好治疗作用，可能成为RILI新的有效的治疗手段。　　基于以上的依据和推测，本课题开展了低氧培养的MSCs对放射性肺损伤治疗作用及机制研究。重点将小鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)进行分离、纯化，观察低氧对BMSCs形态、增殖、分化的影响以及低氧BMSCs对ROS和乏氧的耐受性;通过小鼠放射性肺损伤模型，比较低氧BMSCs和常氧BMSCs对RILI的治疗效果;在以上效应确定的基础上，进一步从细胞水平观察低氧BMSCs对受照肺泡上皮细胞的作用;最后，分别从乏氧诱导因子(HIF-1α)及其相关信号通路激活，以及旁分泌功能等方面探讨低氧BMSCs对RILI的治疗作用机制。　　方法:　　（一）低氧对小鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响　　1、比较不同低氧浓度对BMSCs生长的影响;　　2、选择最佳低氧浓度，观察低氧对BMSCs形态、增殖、分化的影响;　　3、观察在低氧条件下培养的BMSCs内ROS水平及GSH、SOD的变化;　　4、研究低氧条件下培养的BMSCs对ROS和乏氧的耐受性。　　（二）低氧BMSCs对小鼠RILI的治疗作用　　1、检测低氧BMSCs在RILI小鼠肺组织中的归巢情况;　　2、观察低氧BMSCs对小鼠RILI的治疗效果;　　3、探讨低氧BMSCs对RILI小鼠免疫细胞激活及炎症因子表达的影响。　　（三）低氧BMSCs对受照肺泡上皮细胞的作用　　1、观察低氧BMSCs对照后肺泡上皮细胞凋亡的影响，　　2、探讨低氧BMSCs对照后肺泡上皮细胞EMT影响，　　（四）低氧BMSCs治疗RILI的分子机制　　1、研究HIF1-α、Akt在增强低氧BMSCs凋亡抗性中的作用　　(1)观察在重度低氧条件下低氧BMSCs内HIF-1α、Akt及凋亡相关蛋白表达变化;　　(2)抑制HIF-1α表达，进一步探讨其对低氧BMSCs内Akt及凋亡相关蛋白表达的影响;　　(3)抑制HIF-1α表达，探究低氧BMSCs对乏氧耐受性的变化;　　2、探讨低氧BMSCs是否通过外分泌方式以减轻肺泡上皮细胞放射损伤的作用　　(1)利用抗体芯片筛选常氧和低氧BMSCs分泌蛋白的差异，寻找在减轻肺泡上皮细胞放射损伤中的关键效应蛋白;　　(2)验证抗体芯片筛选出的关键效应蛋白，进一步确认低氧BMSCs外分泌方式在减轻肺泡上皮细胞放射损伤的作用机制。　　结果:　　（一）低氧能够改变BMSCs生物学特性，提高对ROS和乏氧的耐受性　　低氧（氧浓度2.5％）可促进BMSC细胞生长，提高BMSCs的活性和增殖能力，加速BMSCs向成骨、成脂分化，促进其成熟;低氧能够增加BMSCs内的GSH、SOD含量，降低BMSCs内ROS的水平;低氧BMSCs较常氧BMSCs具有更强的抗ROS能力和对严重低氧的耐受性。　　（二）低氧BMSCs能够显著减轻小鼠放射性肺损伤　　低氧BMSCs比常氧BMSCs在RILI小鼠肺组织中具有更强的“归巢”能力，更长的存活时间;低氧BMSCs相较于常氧BMSCs更能减少受照后小鼠肺组织早期炎症渗出，减轻肺泡壁增厚程度，降低肺组织中α-SMA阳性率，下调α-SMA表达，抑制了后期肺纤维化的进一步发展;低氧BMSCs能够抑制受照后小鼠免疫细胞的激活，显著减少肺组织内巨噬细胞趋化、聚集数量，降低外周血TNF-α、TGF-β水平，使外周血INF-γ水平呈现出先抑后升的趋势。　　（三）低氧BMSCs可减轻受照肺泡上皮细胞损伤　　通过在体和离体实验发现，低氧BMSCs能显著减少受照小鼠肺泡上皮细胞的凋亡;肺泡上皮细胞(RLE-6TN)照射后与低氧BMSCs共培养，RLE-6TN细胞的E-adherin表达明显上调，同时Vimentin表达明显下调，表现出较强强的抑制EMT作用。　　（四）低氧BMSCs治疗RILI的分子机制　　1、低氧能够诱导HIF-1α上调，抑制线粒体途径凋亡通路的激活，进而提高了低氧BMSCs。　　低氧BMSCs中HIF-1α、Akt本底表达量显著高于常氧BMSCs，重度低氧(1％O2)处理后，常氧BMSCs细胞HIF-1α、P-Akt473及Caspase-3表达逐渐升高，但低氧BMSCs上述三项则无显著改变;抑制HIF-1α表达，重度低氧条件下低氧BMSCs的Caspase-3表达明显上调，Akt的表达并无明显影响，但细胞活力显著降低。以上结果表明，HIF-1α介导了低氧BMSCs对严重低氧的抗性。　　2、低氧BMSCs通过外分泌方式减轻放射性肺损伤　　利用抗体芯片筛选差异倍数大于1.5和小于0.67，p值小于0.05的蛋白一共23种，其中在低氧BMSCs中高表达的有:GM-CSF、IL-4、IL-13、IL-17、MIP-1a、CD27、DtK、MIP-1b，差异倍数最大的是IL-13(Log2FC=2.226)、MIP-1b(Log2FC=2.071)、MIP-1a(Log2FC=1.380);对分泌蛋白进行KEGG分析，发现有显著差异的信号通路主要有Jak-STAT通路、IL-17通路、NF-κB通路、TNF通路、MAPK通路;对以上在低氧BMSCs中高表达的IL-13、MIP-1a、MIP-1b利用ELISA方法进行验证，结果符合芯片筛选结果，在低氧BMSCs中IL-13、MIP-1a、MIP-1b的蛋白表达量均较常氧BMSCs显著增多。结果提示，低氧BMSCs通过外分泌方式减轻放射性肺损伤，作为效应蛋白IL-13、MIP-1a、MIP-1b可能在其中发挥重要作用。　　四、讨论与分析　　放射性肺损伤不同于其它因素造成的肺组织损伤，电离辐射通过产生大量自由基导致的组织损伤环境以及局部的肺组织缺血缺氧的条件，严重影响目前临床药物的治疗效果。近年来研究表明MSCs在多种疾病治疗中均显示出较好的效果，并且发现，低氧条件下MSCs具有更强的增殖、分化能力，特别是发现低氧影响细胞最显著的的效应分子——乏氧诱导因子(HIF-1α)不仅能够促进胞增殖，增强细胞活力，还能增强细胞对辐射耐受作用。　　结论:　　低氧更能促进BMSCs增殖和归巢，提高抗ROS能力和严重低氧的耐受性;低氧BMSCs能够显著减少受照射肺泡细胞凋亡，抑制辐射所致的肺泡细胞EMT的发生，明显减轻照后小鼠肺组织炎症程度，抑制后期肺纤维化的形成，对小鼠RILI具有较好的治疗作用。其作用机制:一方面是通过低氧诱导HIF-1α上调，进而抑制了线粒体途径凋亡通路的激活，发挥了抗肺泡上皮细胞凋亡中的作用;另一方面低氧BMSCs是通过外分泌方式减轻放射性肺损伤，其主要作用效应蛋白IL-13、MIP-1a、MIP-1b可能在其中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词简表

前言

第一部分 低氧对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学特性的影响

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 低氧BMSCs对小鼠RILI的治疗作用

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 低氧BMSCs对受照肺泡上皮细胞的作用研究

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第四部分 低氧BMSCs治疗RILI的分子机制研究

一、材料与方法

二、实验结果

第二节 低氧BMSCs通过外分泌方式减轻肺泡上皮细胞放射损伤的机制研究

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

全文总结

参考文献

综述

在读期间发表论文

致谢