全基因组DNA甲基化分析探索LST在常见信号通路中的特异性表观遗传变异

摘要

研究目的:　　1、探索结直肠侧向发育型肿瘤(laterally spreading tumor,LST)的DNA甲基化特征，尤其是对通常容易被忽略的基因组区域进行分析。　　2、探索LST和隆起型腺瘤(protruded-type adenoma,PA)之间主要的DNA甲基化差异。　　3、通过全基因组DNA甲基化分析来探讨LST在常见信号通路中的特异性表观遗传变异。　　研究方法:　　1、选取入组患者和采集样本　　2、甲基化450k芯片检测　　3、差异性甲基化位点（differentially methylated position，DMP）和差异性甲基化区域(differentially methylated region，DMR)的筛选　　使用配对t检验比较LST组与对照组β值的差异。应用Bonferroni校正后的q值＜0.05，从每组配对比较中筛选LST相关的DMP。利用minfi软件包对DMP的潜在区域聚类进一步分析，确定所组成DMR。　　4、DMP的分布分析　　按所处的基因组区域、染色体位置对DMP进行分层，并在450k芯片中与各自分层相关的区域、位置进行比较。因样本量较小，使用Fisher's独立精确检验来分析特定的基因组区域、染色体位置的DMP数量与预期值的差异是否存在统计学意义。然后再对超甲基化DMP与低甲基化DMP的数量比进行Fisher's精确检验，以评估其是否在每个基因组区域、染色体位置中的分布差异都存在统计学意义。统计学检验水准设定为经Bonferroni校正的α=0.05。　　5、焦磷酸测序验证　　本实验在10组含正常黏膜对照的病例样本中进行研究，另外新增加了9组相同入组标准的病例样本以进行芯片检测结果验证。验证方法为焦磷酸测序。　　6、基因本体（Gene Ontology,GO）和通路富集分析　　7、组蛋白修饰富集分析　　8、公共数据的下载及标准化　　从NCBI基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)下载经过处理的DNA甲基化数据GSE48684。另从GEO下载了一套11对LST和匹配的正常结直肠粘膜的DNA甲基化数据和表达分析数据GSE77635。使用RNA-seq TMM方法标准化处理，来量化转录因子和与IGR DMP和DMR相关的最近基因的表达水平。　　9、使用18态ChromHMM模型计算DMP和DMR的观察值和预期值　　18态的ChromHMM模型从依据hg19标准人类基因组数据的Roadmap表观基因组计划数据库中下载。使用自定义R代码来计算表观基因组n中状态m的DMP和DMR预期总数，然后将研究中观察到的表观基因组n中状态m的DMP和DMR总数，与预期总数进行比较（具体公式详见正文部分）。　　10、识别转录因子结合位点（transcription factor binding site，TFBS）的富集　　从hg19人类基因组数据集中获得了抑制区DMP的基因组序列，并将DMP、DMR和450k探针的检测区间扩展到1000bp。利用MEME套件中的FIMO工具，使用默认脊椎动物数据库进行富集的结合模体查找分析，设定其检验水准q值（经FDR校正的p值）为0.05，当目标序列与背景序列的比值＞1.1，定义为转录因子结合模体的显著富集。　　11、辅助数据的可用性　　本研究相关数据已保存在NCBI的基因表达综合数据库中，登记号为GSE106556。　　研究结果:　　1、在LST中发现DMP与DMR并验证　　首先明确了LST的DNA甲基化异常特点。经严格分析并采用必要的统计学校正方法(Bonferroni校正P＜0.05，图3A)计算分析，确定了10个LST样本中2452个DMP。同时多个染色体的DMP分布差异也具有显著的统计学意义，特别是chrX（P＜3.37×10-18，Fisher's精确检验）和chr8（P＜1.85×10-16，Fisher's精确检验）。值得注意的是，发现了1925个低甲基化的DMP(78.51％)显著高于527个超甲基化的DMP(21.49％)(图3B)。　　然后，利用minfi软件包分析确定了DMR，明确了73个超甲基化DMR和13个低甲基化DMR。　　随后使用焦磷酸测序方法，在研究组及另外9组新病例样本中，验证了位于不同基因组区域的4个位点（P值较小，差异性较大的位点）的甲基化水平（图4），结果发现所有4个位点在各样本中均显示出与450k芯片一致的差异性甲基化状态。　　2、DMP在IGR和TSS高度富集　　3、LST在TSS周围表现出显著的DNA甲基化异常　　4、IGR是LST的DNA甲基化水平异常的热区　　5、IGR的潜在功能　　研究发现“消化系统发育”是低甲基化的IGR-DMP调控的重要生物学功能，其中包括许多重要的发育转录因子，如TGFB2，FOXF1，FOXF2，GATA4，FGF10和FGF9（图8A）。研究同时发现，低甲基化的IGR-DMP与参与组蛋白去乙酰化的基因（HDAC2，HDAC4，HDAC9，NACC2，SALL1和SUDS3）（图8A）相关（组蛋白去乙酰化，-log10(P-值)=4.97）。该结果表明LST发生过程中DNA甲基化和组蛋白修饰之间存在相互作用的可能性。　　6、组蛋白H3K9me3在IGR-DMP高度富集　　7、正常粘膜的抑制区在LST中表现为去甲基化状态，LST中IGR-DMP的低甲基化可能导致转录因子功能失调　　8、LST、PA和CRC之间DMP与信号通路的富集状态　　通过Venn图显示了LST、PA和CRC三者共同重叠的DMP部分，其中有435个基因包含超甲基化DMP，而有517个基因包含低甲基化DMP（图13A）。然后，以信号通路为切入点，对不同类型肿瘤中的DMP进行了研究，发现与正常样本对照相比，CRC的超甲基化DMP中富集了PI3K-AKT通路，PA的超甲基化和低甲基化DMP均有PI3K-AKT通路富集，同时LST的低甲基化DMP也表现出PI3K-AKT的显著变化;然而在LST和PA之间，没有检测到任何共有的常见超甲基化DMP相关通路（图13B）。因此，DNA甲基化的区别在LST和PA之间可能非常明显。这一结果与临床预期的LST和PA之间导致肿瘤转化的分子机制不同是一致的。进一步研究发现在8条重要的表观遗传致病通路中，其DNA甲基化表达情况在LST和PA之间相反(图13C)。如MAGI2，PRKCB，FGF12，PDGFD，NGF，PIK3R5，GRIN2A和PDGFRA（图13D）等在Ras和Rap1信号通路所富集的基因在LST中是低甲基化表达而其在PA中却是高甲基化表达。　　这三种疾病也存在一些共同的表观遗传靶标基因，包括ECM、ITGA、CCDN1和GF（图15）。PI3K家族的IA因子、P21和FasL均表现出LST特异性的表观遗传学变化。相反，PA则表现出RTK-ERK通路的异常，可能导致细胞增殖、血管生成和DNA修复方面的问题。而蛋白质合成和肿瘤代谢异常是CRC的独特表现。　　研究结论:　　1、LST中的DMP在IGR和TSS高度富集，且低甲基化DMP和DMR主要位于IGR。　　2、LST中低甲基化的IGR-DMP通过影响抑制区的非结肠组织或细胞类型的调节元件，可能导致结肠细胞特异性表型的丧失，并可导致肿瘤组织的形成。　　3、PI3K-AKT、Ras和Rap1等信号通路所富集的DMP的DNA甲基化表达情况，在LST和PA之间有很大区别，可能是两者在肿瘤转化的分子机制上存在差异的原因之一。　　4、PI3K家族的IA因子、P21和FasL均表现出LST特异性的表观遗传学变化，而PA则表现出RTK-ERK通路的异常，蛋白质合成和肿瘤代谢异常是CRC的独特表现。　　5、PI3K-Akt信号通路在LST、PA和CRC发生发展中有独特的表观遗传差异，这对LST、PA和CRC患者都具有非常重要的临床意义，可能成为早期监测标志物、治疗靶点和预后判断的生物标志物。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、资料与方法

(一)患者选取和样本采集

(二)实验设计技术路线图

(三)全基因组DNA甲基化分析检测设备和芯片制各

(四)DMP和DMR的识别

(五)DMP分布分析

(六)焦磷酸测序验证

(七)基因本体和通路富集分析

(八)组蛋白修饰富集分析

(九)公共数据库的下载及标准化

(十)使用18态ChromHMM模型计算DMP和DMR的观察值和预期值

(十一)TFBS(转录因子结合位点)鉴别富集物

(十二)辅助数据的可用性

(一)在LST中发现DMP与DMR并验证

(二)DMP在IGR和TSS高度富集

(三)LST在TSS周围表现出显著的DNA甲基化异常

(四)IGR是LST的DNA甲基化水平异常的热区

(五)基因间区(IGR)的潜在功能

(六)H3K9me3在IGR-DMP高度富集

(七)LST中IGR-DMP的低甲基化导致转录因子功能失调

(八)LST、PA和CRC之间DMP与信号通路的富集状态

三、讨论

结论

参考文献

文献综述大肠侧向发育型息肉的转化研究进展

在读期间科研情况

致谢