醛酮还原酶家族1的C1亚型在多发性骨髓瘤中的表达及意义研究

摘要

多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一种血液系统恶性疾病，其特征是骨髓中浆细胞恶性增生，分泌出大量的单克隆免疫球蛋白或其片段，导致患者出现血钙增高、肾功能损害、贫血、骨病等临床表现。MM好发于老年人，主要发病人群的年龄在50-70岁之间，发病率约为1/10万，占全部恶性肿瘤的1％，居血液系统恶性肿瘤的第二位。　　MM病因至今尚不明确，遗传、环境因素、化学物质等都可能与MM的发病有关。蛋白酶体抑制剂等靶向药物在临床上的广泛运用使MM患者的预后明显改善，但只有少数患者能够长期控制骨髓瘤，治疗药物耐药的产生在其中发挥着重要作用。因此，寻找一种能够在诊断、预后判断和整个疾病过程中表征疾病进程及药物敏感性的靶标显得十分必要。　　醛酮还原酶(Aldo-keto reductases，AKR)是一种NADP(H)依赖性的氧化还原酶，参与体内醛酮类化合物清除代谢。AKR1家族主要存在与哺乳动物中，有AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4四个亚型。目前发现，AKR1家族与恶性肿瘤密切相关，能在前列腺癌、乳腺癌中引起特异性的耐药，并通过作为E3-连接酶-泛醌系统中的共激活因子，调节细胞对药物的敏感性并能影响细胞凋亡及远处转移。近来，在GCBI等数据库中检索还发现，AKR1C1主要表达于乳腺癌、肺癌、结肠癌等实体肿瘤中，在非霍奇金淋巴瘤、B细胞性淋巴瘤等血液系统肿瘤中亦见报道。　　基于以上介绍，提出以下疑问:AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞株及MM患者外周血中是否也有异常表达？异常表达的AKR1C1与MM的诊断及预后有无关联呢？它们在MM的发病机制中又起着怎样的作用？为了解决这些问题，本课题运用大量数据统计分析、实时荧光定量PCR、基因转染、流式细胞学等技术进行了以下三部分的研究:1)AKR1C1及其他亚型在多发性骨髓瘤细胞株及患者中的表达情况;2)AKR1C1与多发性骨髓瘤患者临床及预后指标相关性;3）AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞中的生物学作用。　　第一部分:AKR1C1及其他亚型在多发性骨髓瘤细胞株及患者中的表达情况　　AKR1家族作为一种肿瘤相关基因，在实体肿瘤中存在异常表达已被证实。相关研究发现AKR1家族除与前列腺癌、乳腺癌密切相关外，在其他多种肿瘤如非小细胞肺癌、胆管癌、胃癌中表达水平明显异常，并有参与到治疗药物耐药机制的产生中，但AKR1家族在血液系统肿瘤特别是多发性骨髓瘤中表达情况尚未见报导。　　本部分实验主要目的是研究AKR1C1及其他亚型:AKR1C1-AKR1C4在各种多发性骨髓瘤细胞株及部分初诊MM患者外周血中的表达情况。首先，采用荧光定量PCR技术检测多发性骨髓瘤细胞株U266、H929、8226、KM3、LP-1等五个细胞株及正常骨髓CD138+浆细胞中AKR1C1-AKR1C4的表达情况，结果发现，各种多发性骨髓瘤细胞株中AKR1C1-AKR1C4表达水平不尽相同:AKR1C1在MM细胞株H929及U266细胞中的表达水平明显升高，AKR1C2在MM细胞株U266、H929、LP-1中表达水平均升高，AKR1C3在MM细胞株H929、LP-1中表达水平升高，AKR1C4在MM细胞株H929及U266中表达水平升高;而且AKR1C1-AKR1C4均在MM细胞株H929中的表达升高最为显著。接下来，进一步检测分析AKR1C1-AKR1C4在H929细胞中的表达水平，发现在H929细胞中，AKR1C1的表达水平要明显高于AKR1C2、AKR1C3及AKR1C4，且AKR1C4的表达水平最低。其次，为明确AKR1C1及其他亚型在初诊MM患者中的表达情况，收集了21例临床初发MM患者和20例健康对照者的外周血PBMC，利用实时荧光定量PCR技术检测其AKR1C1-AKR1C4的表达水平。结果发现，与健康对照者相比，AKR1C1-AKR1C4在初发MM患者外周血PBMC中的表达量不尽相同:AKR1C1的表达水平异常升高，而AKR1C2、AKR1C3、AKR1C4则在初发MM患者外周血PBMC中未见异常表达。　　上述结果说明，AKR1C1及其他亚型在不同多发性骨髓瘤细胞株中的表达存在明显差异，而且AKR1C1在MM细胞株H929及初发MM患者外周血PBMC中均异常高表达。　　第二部分:AKR1C1与多发性骨髓瘤患者临床及预后指标相关性　　多发性骨髓瘤仍然是一种几乎无法治愈的浆细胞恶性肿瘤，新兴药物如蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、抗CD38单克隆抗体等在临床上广泛运用，MM患者的预后明显改善，但仍只有少数患者能够长期控制骨髓瘤。药物的耐药性在其中发挥着重要作用。因此，寻找一种能够在诊断、预后判断和整个疾病过程中表征疾病进程及药物敏感性的分子显得十分必要。第一部分的实验结果表明，AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞株及初发MM患者PBMC中均显著高表达，但其与多发性骨髓瘤患者病情程度、预后及临床指标间的相关性还需要进一步的探讨。　　本部分实验主要目的是探讨AKR1C1作为多发性骨髓瘤的诊断、预后判断、疗效监测新指标的可能性。首先，分别检测了AKR1C1在不同疾病阶段的MM患者外周血PBMC中的表达水平，发现，与健康对照组相比，初发组、复发组与缓解组MM患者的外周血PBMC中AKR1C1的表达水平均显著升高;而且与缓解组相比，初发组、复发组MM患者的外周血AKR1C1的表达水平有明显升高;但初发组与复发组之间，外周血AKR1C1的表达水平则无明显差异。其次，再分析检测不同预后分期的MM患者中外周血PBMC中AKR1C1的表达水平，发现ISS-Ⅰ期、ISS-Ⅱ期MM患者分别与ISS-Ⅲ期MM患者相比，外周血中AKR1C1表达水平差异明显;而且与其余两组相比，ISS-Ⅲ期MM患者的外周血AKR1C1表达水平最高;但ISS-Ⅰ期与ISS-Ⅱ期之间，外周血AKR1C1的表达水平则无明显差异。最后，又把AKR1C1在MM患者外周血PBMC中的表达水平与MM诊断、分期及预后相关的各种临床参数，包括血κ轻链、κ/λ比值、β2微球蛋白、血清白蛋白、乳酸脱氢酶、血红蛋白、血肌酐、血钙等进行大量的统计学分析。结果发现，AKR1C1在MM患者的外周血表达水平与血清κ轻链的含量呈正相关性、并与κ/λ的比值也显著正相关;还与血清β2微球蛋白含量显著正相关，也与LDH的含量呈正相关性;但是，AKR1C1在MM患者的外周血表达水平与血清白蛋白、血红蛋白、肌酐、血钙均无明显相关性。因此，上述结果提示，AKR1C1在MM中的表达水平与MM疾病的严重程度以及疾病的预后密切相关。　　第三部分:AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞中的生物学作用　　在多发性骨髓瘤患者的临床药物治疗中，部分病人会出现Bcl-2家族蛋白调控失控导致凋亡途径异常，从而出现对治疗药物的耐药。如能让MM患者骨髓瘤细胞恢复正常的凋亡机制，将能够明显提高临床药物的治疗效果。此外，调控细胞自噬也是其多发性骨髓瘤治疗的研究方向之一。通过前两部分的研究，发现AKR1C1在多发性骨髓瘤MM患者外周血PBMC中显著高表达，且异常表达的AKR1C1与MM的病情程度、预后密切相关;但其在MM的发病机制间的相关性还需要进一步的探讨。　　因此，在本部分实验中，首先通过CCK-8方法检测骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对细胞增殖的影响，发现与对照组相比，H929细胞转染siRNA-AKR1C1后细胞增殖率均明显降低;两组的细胞增殖率在12-72h间的各时间点均相差明显;且随着时间的延长，两组间差异逐渐增大，在48h时两组间差异最为明显。其次，为明确AKR1C1对目前治疗MM的主流化疗药物:硼替佐米(Bortezomib，BTZ)的药物敏感性，先研究了转染siRNA-AKR1C1并联用BTZ后对H929细胞增殖的影响。结果发现，对照组与转染siRNA-AKR1C1组的H929细胞增殖均明显受抑制;且与对照组相比，siRNA-AKR1C1组的细胞增殖受抑更为明显;在硼替佐米浓度为20ng/ml时，siRNA-AKR1C1组与对照组间的差异最为明显。然后，又采用流式细胞术检测骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对细胞凋亡的影响;发现与对照组相比，转染siRNA-AKR1C1组的细胞凋亡率明显增加，而且，加入硼替佐米后，转染siRNA-AKR1C1组的细胞凋亡率更要显著高于对照组。接下来，还探讨了骨髓瘤H929细胞转染siRNA-AKR1C1后对凋亡相关分子:Bcl-2、Caspase-3、以及自噬相关分子:p62、LC3表达的影响，结果发现，与对照组相比，转染siRNA-AKR1C1组的Bcl-2的表达减少、Caspase-3的表达则明显增加，且p62的表达明显减少、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换则明显增加。上述结果说明，在骨髓瘤H929细胞中沉默AKR1C1的基因表达后，能够明显抑制细胞增殖、增加细胞凋亡以及H929细胞对硼替佐米的药物敏感性，也能下调Bcl-2的表达、上调Caspase-3的表达，还可以诱导细胞自噬。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 AKR1C1及其他亚型在多发性骨髓瘤细胞株及患者中的表达情况

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分 AKR1C1与多发性骨髓瘤患者临床及预后指标的相关性

一、材料与方法

二、结果

二、讨论

第三部分 AKR1C1在多发性骨髓瘤细胞中的生物学作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

全文总结

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作的情况

致谢