常见皮肤癣菌感染LAMP--微流控高通量诊断芯片的研发

摘要

皮肤癣菌是临床常见的浅部真菌，它是一种丝状真菌，常侵入富含角蛋白的基质中生长，病变累及人的皮肤、毛发和指甲（趾甲）等。临床上常见的皮肤癣菌分为3个属:毛癣菌属（Trichophyton spp.）、小孢子菌属（Microsporum spp.）和表皮癣菌属（Epidermophyton spp.），主要包括红色毛癣菌(T.rubrum)、须癣毛癣菌（T.mentagrophyte）、紫色毛癣菌（T.violaceum）、断发毛癣菌（T.tonsurans）、疣状毛癣菌（T.verrucosum）、许兰毛癣菌（T.schoenleinii）、犬小孢子菌（M.canis）、石膏样小孢子菌（M.gypseum）、铁锈色小孢子菌（M.ferrugineum）和絮状表皮癣菌(E.floccosum)等30余种致病菌种。皮肤癣菌引起的皮肤感染是最高发的浅部真菌病，随着中国人口逐渐进入老龄化状态、临床免疫抑制剂的广泛应用，以及外用糖皮质激素制剂的滥用，浅部真菌病的发病率呈逐年升高趋势。　　目前，临床针对皮肤癣菌感染的诊断仍以镜检+培养为主，通过显微镜观察有无孢子或菌丝，培养之后主要依赖总菌落形态和分生孢子及其他菌丝结构的显微特征帮助鉴别，并辅之以交配实验和生化测试，如脲酶测试或营养测试等。但镜检阳性率低，且对技术人员操作要求较高，无法将真菌鉴定至种属水平。而培养耗时较长，一般要2周左右。组织病理检查对于浅部的皮肤癣菌感染无实际临床意义，患者主观上很难接受。临床皮肤癣菌感染的样本量巨大，急需一种既能快速诊断、又兼顾成本效益的早期诊断方法。　　为了更好的解决临床真菌感染的早期诊断需求，一系列针对病原真菌核酸、蛋白的分子诊断技术已进入实验研究阶段，其中部分技术在临床中已经获得一定的应用。分子诊断技术通过针对病原微生物自身蛋白、核酸等具有特异性成分或序列片段的分析鉴别到达准确诊断的目的，此类技术特异性强、灵敏度高、从取材到报告整个流程耗时短，可在1天内，甚至数小时完成诊断。　　本研究将环介导等温扩增技术与微流控芯片载体相结合，试图开发一套能实现早期快速诊断，同时高效、价廉的诊断方法。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种可以在恒温条件下实现核酸高倍扩增的技术，该扩增技术消除了聚合酶链式反应(PCR)所需的温度循环，同时获得了类似的扩增产量。LAMP技术不仅特异性强、敏感度高，而且因其恒温扩增的原理对实验条件要求不高，便于临床推广。目前，LAMP技术已经被应用于多种真菌、病毒、细菌以及分枝杆菌等病原微生物的诊断。而微流控芯片技术是使用微管道进行实验反应和样本检测等，具有微型化、集成化等特点。根据通道的设计，可以在芯片上产生所需的微环境条件，利用微流控芯片技术可以实现短期内数十甚至上百例样本的同时鉴定。　　本研究是针对皮肤癣菌的三个属分别设计对应的三套属引物，引物的设计首先通过Pubmed将各属内的皮肤癣菌菌种rDNA（包括18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S等）序列下载下来，经Geneious软件分析比对，寻找属内各菌种高度近似的目的靶基因，该靶基因片段要与其他属的菌种序列或者系统进化树上临近菌种的序列明显不同。然后利用LAMP引物设计软件Primer ExplorerV4设计引物（两个外引物，F3和B3;两个内引物，FIP和BIP，为缩短反应时间时可增加环引物LB和LF）。然后筛选引物，优化反应体系，并测试体系的特异性和敏感性，接着将验证后的体系装入微流控芯片中进一步验证，最后利用搜集的临床标本进行临床验证。研究共用菌株113株，其中包括红色毛癣菌20株、须癣毛癣菌20株、紫色毛癣菌11株、断发毛癣菌4株、疣状毛癣菌3株、许兰毛癣菌8株、犬小孢子菌16株、铁锈色小孢子菌3株、絮状表皮癣菌6株，常见念珠菌5株，马拉色菌5株，曲霉4株，青霉2株，红酵母2株，细菌4株，和人DNA(sigma)1份。各属内菌种核酸为对应属引物的阳性样本，其他菌株核酸为对照样本。　　经研究发现LAMP技术对毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属内的常见皮肤癣菌鉴定特异性可以达到100％，在敏感性上可以达到1×102拷贝/μL左右。验证后反应体系在微流控芯片中也得到了很好的验证，特异性与敏感性同LAMP技术。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

(一)皮肤癣菌流行病学调查

(二)选题依据及研究意义

材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

结果

(一)实验菌株的鉴定

(二)LAMP技术特异性及敏感性验证

(三)微流控特异性及敏感性验证

讨论

参考文献

全文总结

(一)研究结论

(二)工作展望

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢