长链非编码RNA(lncRNA--ITGA2)在人血管平滑肌细胞增殖中的作用及相关机制研究

摘要

目的：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的重要发生机制，已成为威胁人类健康的最主要疾病之一。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是构成血管壁结构、维持血管张力的主要细胞成分，其损伤后的过度增殖和迁移是导致动脉粥样硬化发生发展、支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)和肺动脉高压等血管增殖性疾病的重要病理基础。血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)是包括VSMCs在内的多种细胞的强大有效的促增殖剂，在VSMCs的过度增殖和迁移过程中，PDGF-BB信号通路发挥着重要作用，但目前PDGF-BB信号通路参与VSMCs增殖和迁移等生物学进程的具体机制尚不完全清楚。　　基因组学研究表明，哺乳动物基因组中可转录本超过90％，但仅有约2％转录为蛋白编码基因，约98％转录为非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）。ncRNA主要包括两类:长度为21-23nt的非编码小RNA（mircoRNA，miRNA）和长度大于200nt的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。已有大量研究证明，miRNA在多种生物和病理学过程中以及疾病发生发展中发挥重要作用，具体的分子机制也已经比较清楚。近年来，随着二代测序技术的广泛应用，曾经被认为是转录“噪声”的lncRNA，亦被大量研究证明具有重要的生物学功能。目前已发现，lncRNA可在多水平调节基因表达，包括基因组印记、染色质修饰、转录激活与调控、核内运输等多种生物学过程。在肿瘤发生发展过程中lncRNA如何发挥调控作用已有大量研究结果报道，但在心血管疾病发生发展过程中，lncRNA的功能研究仍处于起步阶段，值得进一步深入探讨。　　前期我们在PDGF-BB诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(human aortic-VSMCs，HA-VSMCs)增殖模型中，利用lncRNAs芯片技术筛选差异lncRNA。通过生物信息学分析及后续qRT-PCR技术验证，我们鉴定出一条在HA-VSMCs增殖模型中，表达显著上调的lncRNA，命名为lncRNA-ITGA2。通过RACE实验成功获得lncRNA-ITGA2全长序列后利用核质分离技术和RNA原位杂交技术检测了其在HA-VSMCs细胞定位情况，主要定位于细胞核。在生物学功能研究中，利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）及腺病毒(adenovirus)转染技术实现lncRNA-ITGA2在HA-VSMCs中的敲减和过表达，通过多种检测方法，发现在HA-VSMCs中沉默lncRNA-ITGA2表达可以显著抑制PDGF-BB诱导的HA-VSMCs增殖和迁移，并促进凋亡。过表达lncRNA-ITGA2分子水平后，可以进一步上调PDGF-BB分子所具有的促细胞增殖和迁移能力。在针对lncRNA-ITGA2作用机制研究上，我们首先在HA-VSMCs中转染siRNA沉默lncRNA-ITGA2表达，抽提RNA后进行转录组测序筛选靶基因，通过差异基因筛选、基因聚类分析、功能和信号通路分析等生物信息学手段，结合lncRNAs芯片分析结果及在线预测等手段，发现lncRNA-ITGA2可能调控的靶基因为ITGA2分子，经qRT-PCR和Western blot技术证明lncRNA-ITGA2通过调控ITGA2-FAK信号通路发挥调节细胞增殖迁移的能力。双荧光素酶报告基因检测实验发现lncRNA-ITGA2不能直接结合ITGA2启动子区增加其转录水平，但可以通过类增强子效应促进ITGA2转录。CHIRP-DNA实验发现，lncRNA-ITGA2可以与其基因组互补区DNA序列直接结合，上调ITGA2分子转录活性。ChIP实验发现lncRNA-ITGA2可以通过增加ITGA2基因位点的H3K27ac的组蛋白修饰，进而促进ITGA2的转录。同时在人动脉粥样硬化血管组织，经Western blot检测及免疫组化检测发现ITGA2表达水平在动脉粥样硬化病变血管中显著增加，并且在冠心病组患者的血浆标本中检测到lncRNA-ITGA2的表达量显著高于非冠心病组。综上所述，在HA-VSMCs中，lncRNA-ITGA2主要通过调控激活ITGA2-FAK信号通路，促进血管平滑肌细胞的过度增殖和迁移，促进动脉粥样硬化发生发展。　　第一部分 长链非编码RNA lncRNA-ITGA2的筛选和鉴定　　方法:(1)我们首先对lncRNAs芯片结果进行生物信息学分析获得候选的差异lncRNA。(2)接下来通过qRT-PCR实验，验证候选lncRNA在HA-VSMCs增殖模型中表达水平。(3)通过RACE实验获得目标lncRNA全长转录本序列，运用开放数据库预测目标lncRNA编码潜能。(4)通过普通PCR实验明确目标lncRNA在HA-VSMCs中表达丰度。(5)通过核质分离实验和RNA原位杂交实验确定目标lncRNA的核质定位情况。　　结果:(1)通过对lncRNAs芯片检测到的lncRNA和mRNA进行差异表达分析、聚类分析、GO富集分析、Pathway信号通路分析和共表达分析等生信分析手段筛选得到6条lncRNA与细胞增殖能力相关性较好。(2)利用qRT-PCR技术，发现lncRNA-ITGA2在PDGF-BB和10％FBS诱导的HA-VSMCs增殖模型中表达水平均显著升高。(3)通过RACE实验成功获得lncRNA-ITGA2全长转录本序列，为4939bp。开放数据库预测分析结果表明lncRNA-ITGA2不具有蛋白编码能力。(4)普通PCR产物行琼脂糖胶电泳发现lncRNA-ITGA2在不同来源的人细胞系中具有选择表达性，且在HA-VSMCs中选择性高表达。(5)核质分离和RNA原位杂交实验发现，lncRNA-ITGA2主要定位于细胞核。　　结论:通过在PDGF-BB诱导的HA-VSMCs增殖模型中进行lncRNAs芯片检测和生信分析及后续分子生物学实验，验证获得了一条与HA-VSMCs增殖密切相关的全新lncRNA，命名为lncRNA-ITGA2，其全长为4939bp，主要在细胞核富集。　　第二部分 lncRNA-ITGA2促进人血管平滑肌细胞的增殖活性和迁移能力　　方法:(1)转染针对lncRNA-ITGA2的siRNA和过表达腺病毒，利用qRT-PCR技术检测siRNA和腺病毒对lncRNA-ITGA2的敲减和过表达效率。(2)CCK-8检测试剂盒检测lncRNA-ITGA2敲减或者过表达对HA-VSMCs增殖活性的影响。(3)EdU-488检测试剂盒检测敲减lncRNA-ITGA2对HA-VSMCs增殖能力的影响。　　结果:(1)在HA-VSMCs中转染Si-lncRNA-ITGA2和Ad-lncRNA-ITGA2可以有效的敲减和过表达lncRNA-ITGA2分子水平。(2)CCK-8细胞增殖检测发现，敲减或者过表达lncRNA-ITGA2可以分别抑制和增强HA-VSMCs的增殖能力，且可以部分抵消或者增强PDGF-BB所具有的促细胞增殖能力。(3)EdU-488细胞增殖检测发现，敲减lncRNA-ITGA2表达可以显著下调HA-VSMCs增殖活性，部分抵消PDGF-BB促细胞增殖能力。　　结论:在HA-VSMCs中转染Si-lncRNA-ITGA2和Ad-lncRNA-ITGA2，经相关实验检测，发现lncRNA-ITGA2可以加快HA-VSMCs周期进程，增强细胞增殖、迁移能力。　　第三部分 lncRNA-ITGA2通过调控ITGA2分子表达协同促进人血管平滑肌细胞增殖迁移，加速动脉粥样硬化进程　　方法:(1)通过敲减lncRNA-ITGA2后进行转录组测序及生信分析等方法寻找lncRNA-ITGA2可能调控的下游靶基因和信号通路。(2)通过qRT-PCR和Western blot实验检测lncRNA-ITGA2敲减或过表达后对下游靶基因ITGA2及信号通路蛋白FAK的调控情况，通过细胞免疫荧光技术检测lncRNA-ITGA2敲减后对ITGA2分子表达的影响。　　结果:(1)通过转录组测序及生信分析预测，筛选出ITGA2分子可能是lncRNA-ITGA2下游靶基因。(2)lncRNA-ITGA2敲减或者过表达可以分别下调或者上调ITGA2分子mRNA水平和蛋白水平，并且敲减lncRNA-ITGA2表达可以显著抑制PDGF-BB诱导的FAK磷酸化水平。(3)ITGA2分子的mRNA水平和蛋白水平在PDGF-BB诱导的HA-VSMCs增殖模型中显著上调。(4)敲减或者过表达ITGA2分子对lncRNA-ITGA2表达水平无影响。　　结论:(1)在PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖模型中，lncRNA-ITGA2显著上调。　　(2)lncRNA-ITGA2可以作为一个重要的调控因子通过调控ITGA2分子表达协同促进血管平滑肌细胞增殖迁移。　　(3)lncRNA-ITGA2在细胞核内通过直接结合其互补序列和上调ITGA2启动子区域H3K27ac乙酰化水平协同增加ITGA2转录活性，两者协同激活ITGA2-FAK信号通路，促进血管平滑肌细胞增殖迁移，加速动脉粥样硬化进程。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分长链非编码RNA lncRNA-ITGA2的筛选和鉴定

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分lncRNA-ITGA2促进人血管平滑肌细胞的增殖活性和迁移能力

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第三部分lncRNA-ITGA2通过调控ITGA2分子表达协同促进HA-VSMCs增殖迁移，影响动脉粥样硬化进程

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

全文总结

附录

参考文献

综述长链非编码RNA在心血管疾病中的作用

在读期间论文发表和参与科研工作情况

致谢