线粒体功能障碍介导内质网应激在心肌缺血再灌注损伤中对心肌细胞的功能影响及机制研究

摘要

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是指缺血心肌恢复正常灌注后，细胞或者组织的结构损伤和功能障碍反而呈进行性加重的病理生理现象，在心内直视手术、冠状动脉搭桥术、冠状动脉腔内成形术以及溶栓术后等发生率极高。I/R可导致严重的并发症，甚至会引发恶性心律失常而导致猝死，是影响临床疗效的重要因素，其发生、发展的机制以及如何有效地预防或改善心肌I/R损伤，一直都是心血管基础和临床研究的热点和焦点。　　针对心肌I/R损伤发生机制的研究进行了数十年，但由于高仿真模拟临床心肌缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）细胞模型构建存在困难，且涉及通路和信号分子复杂等原因，导致其真正的原因和机制尚未完全阐明。目前认为主要与心肌细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)过量产生、钙离子超负荷(calcium overload)、炎症细胞活化及能量代谢障碍有关。且越来越多证据表明线粒体功能异常和内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在心肌I/R损伤中扮演了重要角色，但现有研究多聚焦于ERS介导的凋亡通路，对于存活细胞的舒缩功能、细胞内[Ca2+]cyt浓度及钙敏感性改变等研究较少。　　本研究通过构建高度模拟临床心肌I/R损伤的原代分离成年大鼠心肌细胞H/R模型，观察H/R过程中存活心肌细胞舒缩功能、细胞内[Ca2+]cyt浓度及钙敏感性的变化，明确线粒体结构和功能的改变情况，并通过采用ROS清除剂等线粒体保护措施，研究其对ERS通路的激活和存活心肌细胞结构和功能的影响，探索其中可能存在的分子机制及通路，从而为临床心肌I/R损伤的预防和治疗提供理论依据和循证医学证据。　　研究目的：　　（一）明确H/R过程中，心肌细胞收缩功能、细胞内[Ca2+]cyt浓度以及钙敏感性的变化并探讨可能存在的机制;　　（二）明确H/R过程中，线粒体结构和功能的改变情况并探究有效的保护方案;　　（三）明确H/R过程中，通过保护线粒体的结构和功能对ERS通路激活以及心肌细胞结构和功能影响并探讨可能存在的机制。　　研究方法：　　（一）原代分离成年大鼠心肌细胞H/R模型的构建研究　　采用Langendorff离体心脏灌流系统分离原代的成年大鼠心肌细胞，随机分为对照组（CTL组）和缺氧/复氧（H/R组），利用Mayo Clinic构建的气液混合瓶和流量控制泵系统，动态调控细胞培养皿所在腔室内气体和灌注液氧浓度。CTL组持续灌注37℃正常氧浓度含葡萄糖的1.8mmol/L Ca2+Tyrode溶液;H/R组首先在低氧环境中灌注37℃低氧浓度不含葡萄糖的1.8mmol/L Ca2+Tyrode溶液30min，之后在正常氧浓度环境中恢复灌注37℃正常氧浓度含葡萄糖的1.8mmol/L Ca2+Tyrode溶液120min，用来模拟心肌细胞H/R的过程。　　利用IonOptix系统、激光扫描共聚焦荧光显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)、免疫荧光法、氧浓度测定探针及细胞内氧含量测定试剂盒等，对原代分离的成年大鼠心肌细胞的纯度以及模型构建可靠性等进行研究和验证。　　（二）H瓜对心肌细胞线粒体形态和功能影响的研究　　实验细胞随机分为CTL组、H/R组、缺氧复氧+SDH抑制剂丙二酸(Malonate)组(缺氧复氧前加入SDH抑制剂Malonate5mmol/L孵育30min)以及缺氧复氧+ROS清除剂(TEMPO)组(缺氧复氧前加入ROS清除剂TEMPO1mmol/L孵育30min)，展开线粒体结构和功能的检测，利用电子显微镜观察线粒体的结构变化，利用SDH试剂盒测定线粒体琥珀酸浓度以及SDH活性，并利用激光扫描共聚焦荧光显微镜检测线粒体ROS以及线粒体膜电位变化，利用Western blot测定线粒体动力相关蛋白1（dynamin-related protein1，Drp1）和线粒体融合蛋白2（mitofusin-2，Mfn2）的表达情况，从而明确H/R损伤时存活心肌细胞线粒体形态和功能的变化。　　（三）线粒体功能保护对ERS通路及心肌细胞结构功能影响的机制与防治研究　　实验细胞随机分为CTL组、H/R组以及TEMPO组，利用Western blot和Phos-tag技术，检测ERS的三条主要通路——蛋白需要肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme1α，IRE1α)-X盒结合蛋白1(X-box binding protein1，XBP1)通路、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)-真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor2α，eIF2α)通路以及活性转录因子(activating transcription factor6，ATF6)通路的激活情况，尤其是IRE1α和PERK的磷酸化水平，以及ATF6的剪切情况，从而明确保护线粒体对ERS通路的影响。同时，检测单个心肌细胞的舒缩功能、[Ca2+]cyt浓度、钙敏感性的改变以及细胞内cTnⅠ的磷酸化水平的改变等，具体方法同前。　　研究结果：　　（一）原代分离成年大鼠心肌细胞H/R模型的构建　　1、原代分离大鼠心肌细胞H/R模型构建可靠性测定　　根据氧浓度测定探针和细胞内氧含量测定试剂盒的结果，证实灌注液实际氧浓度以及细胞内氧浓度在模型构建中均达到预期标准，模型构建可靠。　　2、大鼠原代心肌细胞的纯度鉴定　　激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察，可见被细胞核染剂4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）标记为蓝色的细胞核，对应的大多为强黄绿色荧光的细胞，提示细胞纯度较高，计算大鼠心肌细胞纯度为98.35±0.67％。　　3、原代分离大鼠心肌细胞的存活率测定　　台盼蓝(Trypan Blue)染色显示，缺氧30min后，CTL组和H/R组细胞存活率分别为68.37±3.01％和63.63±2.87％(P=0.024)，复氧120min后，存活率分别为62.35±3.16％和51.84±3.92％(P＜0.01);提示缺氧过程会造成细胞损伤，降低心肌细胞存活率，而复氧过程可加重细胞的损伤程度，细胞存活率随复氧时间增加进一步降低，提示出现H/R损伤。　　4、大鼠原代心肌细胞的形态学观察　　分离后的原代大鼠心肌细胞成短柱状、形态完整、立体感强、折光性好，长宽比为4～6∶1，细胞横纹清晰，无电刺激条件下，1/3心肌细胞出现低频率(0.2Hz)的收缩，与人类心肌细胞不同，大鼠心肌细胞约80％为双核细胞，20％为单核。　　（二）H/R对心肌细胞线粒体形态和功能影响的研究　　1、电镜下线粒体的结构改变　　电镜下CTL组可见大量线粒体围绕在内质网附近，线粒体膜和嵴的结构清晰完整，未见分裂线粒体;H/R组可见大量线粒体处于分裂中，线粒体膜结构不完整、线粒体嵴消失，提示异常分裂增强;TEMPO组可见80％以上线粒体结构完整，只有约10％处于分裂状态，提示清除ROS能有效维持线粒体结构的稳定。　　2、线粒体分裂/融合相关蛋白表达情况　　Western blot结果显示，缺氧复氧后H/R组心肌细胞Drp1表达较CTL组增加(P＜0.01)，而Mfn2表达量降低(P＜0.01)，加入ROS的清除剂TEMPO后，这一趋势得到明显改善（P=0.041，P＜0.01）。提示ROS可诱导Drp1激活以及降低Mfn2表达，从而促进线粒体分裂，促进更多ROS产生的同时加重钙负荷，导致线粒体功能障碍，形成恶性循环。　　3、琥珀酸浓度及SDH活性变化情况　　SDH试剂盒测定结果显示，与CTL组相比，缺氧30min后H/R组琥珀酸浓度升高（P＜0.01），H/R组复氧120min后SDH活性高于CTL组(P＜0.01)。　　4、线粒体ROS水平变化情况　　MitoSox选择性检测线粒体ROS水平，并使用H2O2进行校准后显示，缺氧复氧后，H/R组ROS水平较CTL组升高(P＜0.01)，而加入SDH抑制剂TEMPO后ROS降低(P=0.034)，提示SDH活性与ROS产生密切相关，SDH活性升高可能是线粒体功能障碍的起始原因之一。　　研究结论：　　1、心肌细胞H/R过程中会出现细胞内钙超载，导致心肌细胞舒缩功能减弱和钙敏感性降低，其机制可能与cTnⅠ的磷酸化水平升高有关;　　2、心肌细胞H/R过程中出现琥珀酸的缺血性蓄积，引发SDH活性的升高以及ROS的异常增加，从而导致线粒体结构和功能的障碍;　　3、H/R过程中，心肌细胞结构和功能改变的具体机制与线粒体功能障碍介导的ERS有关，使用ROS清除剂可维持线粒体的正常结构和功能，抑制ERS通路的过度激活，从而改善心肌细胞的结构和功能。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分原代分离成年大鼠心肌细胞缺氧复氧模型的构建研究

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

参考文献

第二部分H／R对心肌细胞线粒体形态和功能影响的研究

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、小结

参考文献

第三部分线粒体功能障碍介导ERS影响肌细胞功能的机制与防治研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小-结

参考文献

全文总结

综述 内质网与线粒体在心肌缺血再灌注损伤中作用机制的研究进展

攻读学位期间发表论文和科研工作情况

致谢