应激通过自噬调节肠道的微生态促进炎症性肠病的发生发展

摘要

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一组病因尚不明确的慢性复发性胃肠道疾病的统称，主要分为溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)两大类。近年来的流行病学报道显示，IBD的发病率呈逐年上升的趋势，已经成为严重影响人类健康的常见肠道疾病之一。近期多项长期随访研究发现抑郁、焦虑等心理应激事件可增加非活动期IBD复发的风险，促进肠道炎症。从病理生理学角度考虑，机体对应激的生理反应是激活下丘脑-腺垂体-肾上腺皮质轴，释放促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)，其中CRH作为机体应激反应中的重要调节因子，通过中枢或外周受体调节内分泌、神经、免疫系统以及肠道等器官以应答应激所造成的刺激。既往研究早已证实除了中枢系统之外，CRH受体也广泛存在于外周组织，包括十二指肠、小肠及结肠等消化器官。最近的动物实验证实外周注射CRH可对十二指肠黏膜造成与母爱剥夺相似的应激效果。因此，上述多项研究均提示CRH通过外周机制与肠道黏膜功能障碍的发生发展密切相关。但是应激是通过何种机制影响肠道内环境、再次激活IBD的炎症状态、加重病情严重度，目前尚无定论。　　（一）应激通过自噬加重IBD患者肠道组织的炎症　　肠道屏障是指肠道能防止肠腔内的有害物质（细菌和毒素等）穿过肠道黏膜进入体内其它组织器官和血液循环的结构和功能的总和。随着对IBD的病理生理机制研究的深入，人们逐渐认识到:肠道黏膜屏障功能障碍在IBD的发病机制中起着越来越重要的作用。作为维持细胞健康的重要机制之一，自噬已被证明在多种疾病中发挥着关键的作用。近年来，多项研究发现自噬参与IBD的发生发展:有研究学者发现肠道基础水平的自噬可以通过控制炎症诱导的细胞凋亡、维持肠道黏膜屏障的完整性等机制来发挥抑制炎症的作用。但是也有研究指出肠道黏膜细胞自噬的异常增多可以导致肠道黏膜屏障功能受损，被认为是IBD的重要启动因素之一。因此，通过以上研究可以看出:自噬在IBD的发生发展过程中起重要作用，但自噬是否参与应激对IBD病情的调控，目前尚无相关研究报道。在本部分的研究中，主要通过对23例IBD患者基本信息、内镜表现以及肠道组织活检标本的分析，探索心理社会压力与IBD病情活动度及自噬水平的关系。　　1、应激水平与IBD患者肠道的炎症水平呈正相关　　本研究采用Cohen Perceived Stress Scale(CPSS)对患者的认知应激进行评估。通过对轻/中度和重度IBD患者的应激水平进行比较发现:重度IBD组患者的CPSS评分显著高于轻度/中度IBD组患者的CPSS评分，提示应激可能影响IBD患者肠道炎症的严重程度;Spearman等级相关性分析提示患者的应激水平与肠道疾病活动度存在中度正相关关系;此外，实验结果显示CPSS评分高的IBD患者结肠内镜下评分、炎症浸润程度以及M1型促炎细胞的数量均显著高于CPSS评分低的IBD患者。　　2、应激使IBD患者肠道组织的自噬水平升高　　选择了CPSS评分最低的6位IBD患者和CPSS评分最高的6位IBD患者，收集肠道活检组织进行相关实验。发现CPSS评分高的IBD患者肠道组织中自噬相关指标LC3的表达水平显著高于CPSS评分低的IBD患者，提示应激使IBD患者肠道组织的自噬水平升高。此外，相对于健康对照组，IBD患者Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG15L1以及ATG4B的蛋白水平明显升高，且重度IBD组显著高于轻中度IBD组。此外，改良Mayo评分与Beclin-1或LC3-Ⅱ/Ⅰ比率之间存在着正相关关系;社会心理压力评分也与Beclin-1或LC3-Ⅱ/Ⅰ比值呈正相关。综上，心理社会压力越大的IBD患者其肠道自噬水平越高。　　(二)CRH对炎症性肠病小鼠应激后肠道屏障功能和肠道微生态影响　　正常情况下肠道屏障功能主要由机械屏障、免疫屏障、生物屏障、化学屏障四个部分组成。其中，Paneth细胞可以分泌大量的抗菌肽抵抗肠道致病菌的侵袭，是肠道先天性免疫的重要效应器。正常情况下，Paneth细胞主要分布在小肠，但是早在50年前就有研究发现结肠在慢性炎症的反复刺激下可以出现Paneth细胞的化生。但是由于研究方法的限制，目前关于Paneth细胞功能的相关研究特别是其在IBD炎症再激活过程中的作用研究较少，值得进一步探讨。此外，肠道是人体最大的细菌库。已有研究指出应激状态下可使肠道黏膜屏障功能受损，引起肠内细菌失衡及移位。因此，肠道微生态也是参与IBD发生发展的重要因素之一。在这一部分研究中，主要采用葡聚硫酸糖钠(Dextran sulfate sodium，DSS)诱导IBD小鼠模型，探讨CRH对IBD小鼠应激后肠道屏障功能和肠道微生态影响。　　1、CRH对IBD小鼠模型体重、疾病活动度评分以及结肠长度的影响　　相对于对照组，DSS组小鼠出现体重下降，疾病活动度评分(Disease activity index，DAI)上升，结肠长度明显缩短，且两组间的差异均具有统计学意义。更为重要的是，给予IBD小鼠腹腔注射CRH后可进一步加重上述改变。　　2、CRH促进了IBD小鼠模型炎症的发展　　DSS组小鼠肠道组织中TNF-α，IL-18，IL-7，MPO的浓度以及MPO的活力较对照组小鼠显著提高;在DSS的基础上通过腹腔注射CRH模拟应激刺激后，肠道组织中上述炎症指标的水平进一步提高。此外，DSS+CRH组小鼠血浆中TNF-α和IL-18的表达水平也显著高于DSS组。随后，通过H&E染色的方法，进一步评估了CRH对IBD小鼠模型结肠组织结构的影响，同样发现CRH可以加重IBD小鼠结肠组织结构的破坏和炎症细胞的浸润。　　3、CRH促进了IBD小鼠模型中结肠Paneth细胞的化生　　相对于对照组，DSS组小鼠左半结肠出现Paneth细胞化生的比例显著提高;相对于DSS组，DSS+CRH组小鼠左半结肠组织中Paneth细胞化生的现象更加明显。　　4、CRH加剧了IBD小鼠模型肠道微生态的紊乱　　采用了LEfSe分析的方法进一步对DSS+CRH组和DSS组之间的微生物组成成分的差异进行了比较。通过轮状图以及LDA值，可以发现DSS+CRH组和DSS组两组之间确实存在着显著的差异。同时，还发现与对照组相比，DSS组中Turicibacter，Ruminococcaceae和Lactobacillus的比例显著下降，而大肠杆菌属、克雷伯氏菌属和Parabacteroides属的比例则明显增加。更为重要的是，CRH的使用进一步加剧了IBD中的上述变化。　　（三）CRH通过影响肠道自噬参与IBD的发生与发展　　作为维持细胞健康的重要机制之一，自噬已被证明参与人体多种疾病的病理生理过程。虽然肠道基础水平的自噬可以通过控制炎症诱导的细胞凋亡、维持肠道黏膜屏障的完整性发挥抑制炎症的作用，但也有研究指出肠道黏膜细胞自噬的异常增多可能是IBD肠道屏障功能受损的重要启动因素之一。在本研究课题中，主要通过腹腔注射自噬的抑制剂氯喹来抑制机体的自噬过程。此外，还使用了自噬诱导剂雷帕霉素进一步探讨自噬在CRH调控IBD发生发展中的作用。　　1、CRH使IBD小鼠模型肠道组织自噬水平升高　　相比较于DSS组小鼠，DSS+CRH组小鼠左半结肠组织中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达水平以及自噬小体的数目显著提高，而p62/SQSTM1蛋白的表达水平显著降低，提示CRH可以提高IBD小鼠模型结肠组织中的自噬水平。此外，对结肠组织的自噬列阵分析也发现与上述一致的改变。例如:与DSS组相比，PIK3R4，Atg4B，DRAM1等蛋白的表达水平显著提高，而GAA，HSP，CTSD和PPKAA1在DSS+CRH组中则被显著下调。　　2、给予自噬抑制剂氯喹，可以缓解CRH对IBD小鼠模型炎症的加重以及Paneth细胞的化生　　相比较于DSS组，通过外周途径给予CRH后，可显著加重DSS诱导的IBD小鼠的症状、提高炎症因子的表达、加重肠道组织病理结构的破坏，并引起结肠Paneth细胞的化生;但是在给予自噬抑制剂氯喹以后，CRH的上述效果则被显著抑制。　　3、给予自噬诱导剂雷帕霉素，进一步证明CRH通过诱导自噬参与对IBD的调控　　相比较于DSS组，通过外周途径给予CRH后，可显著加重DSS诱导的IBD小鼠的症状，提高炎症因子的表达及肠道组织结构的破坏。在给予自噬诱导剂雷帕霉素以后，CRH的上述效果并没有得到进一步加强;但是却进一步促进了结肠Paneth细胞的化生。这就提示，CRH诱导的结肠Paneth的化生与自噬密切相关。　　综上所述，我们的数据表明CRH通过调节肠道自噬影响肠道微生物态并促进炎症的发展。本研究的数据显示自噬是心理社会应激相关IBD的有希望的治疗靶点，而针对自噬的相关研究和治疗手段有望成为对现有治疗方法的重要补充和发展。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

第一部分应激通过自噬加重IBD患者的肠道组织炎症

一、实验结果

二、分析与讨论

三、结论

参考文献

第二部分CRH对IBD小鼠应激后肠道屏障功能和肠道微生态影响

一、实验结果

二、分析与讨论

三、结论

参考文献

第三部分CRH通过影响肠道自噬参与IBD的发生与发展

一、实验结果

二、分析与讨论

三、结论

参考文献

第四部分CRH通过调节巨噬细胞的自噬及极化参与IBD的发生与发展

一、实验结果

二、分析与讨论

三、结论

参考文献

综述:Impact of Paneth Cell Autophagy on Inflammatory Bowel Disease

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢