MicroRNA--210在退变椎间盘中高表达抑制髓核细胞自噬

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：　　第一部分:人退变椎间盘组织中自噬水平以及microRNA-210表达水平的改变　　目的:提取椎间盘退变(IDD)病人和腰椎骨折病人椎间盘组织髓核细胞作为病例组和对照组，研究退变椎间盘组织中髓核细胞自噬水平以及microRNA-210表达水平的改变。　　方法:随机选取腰椎骨折病人6例（5男1女，平均年龄22.2岁，年龄段分布18-25岁）作为对照组，椎间盘退变病人24例（16男8女，平均年龄51.4岁，年龄段分布39-60岁）作为病例组。提取髓核细胞，western blot检测病例组和对照组髓核细胞LC3Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1表达量;qRT PCR分别测定病例组和对照组髓核细胞microRNA-210表达量。　　结果:western blot检测结果病例组（椎间盘退变病人）比对照组（腰椎骨折病人）髓核细胞LC3Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1表达量明显降低;MDC染色显示病例组自噬水平低于对照组;qRT PCR测定结果病例组（椎间盘退变病人）比对照组（腰椎骨折病人）髓核细胞microRNA-210表达量明显升高(1.01±0.11比0.64±0.11，t=8.239，P＜0.01)。　　结论:人退变椎间盘组织中髓核细胞自噬水平明显降低，microRNA-210表达水平明显升高。　　第二部分:microRNA-210通过调节髓核细胞自噬影响髓核细胞外基质代谢　　目的:研究退变椎间盘髓核细胞中microRNA-210对髓核细胞自噬及髓核细胞外基质代谢的作用以及髓核细胞自噬对髓核细胞外基质代谢的影响。　　方法:(1)将microRNA-210 mimic,microRNA-210 inhibitor,microRNA-210mimic control，microRNA-210 inhibitor control转染到退变椎间盘髓核细胞中，qRTPCR，western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1表达量以及Ⅱ型胶原，蛋白多糖，基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达量。(2)用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和microRNA-210 inhibitor干预髓核细胞，分四组:A组.microRNA-210 inhibitor(-),3-MA（-）;B组.microRNA-210 inhibitor(-),3-MA(+);C组.microRNA-210 inhibitor(+),3-MA(-);D组.microRNA-210 inhibitor(+)，3-MA(+)。qRT PCR检测Ⅱ型胶原，蛋白多糖，基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶-13的mRNA表达量。　　结果:(1)过表达microRNA-210会导致LC3Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1，Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达量降低;基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达量升高;敲除microRNA-210导致LC3Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1，Ⅱ型胶原，蛋白多糖表达量升高，基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达量降低。(2)3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬导致Ⅱ型胶原，蛋白多糖表达量降低，基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达量升高;3-MA会减弱microRNA-210对Ⅱ型胶原和蛋白多糖的调节作用。　　结论:microRNA-210会抑制退变椎间盘髓核细胞自噬并促进退变椎间盘髓核细胞外基质降解;髓核细胞自噬参与细胞外基质代谢，促进细胞自噬会抑制细胞外基质降解，抑制细胞自噬会促进细胞外基质降解。　　第三部分:ATG7为microRNA-210的靶基因并参与退变髓核细胞外基质代谢　　目的:验证microRNA-210直接与靶基因ATG7的3'UTR结合;ATG7参与退变髓核细胞外基质代谢。　　方法:(1)通过TargetScan预测分析microRNA-210可能的靶基因及存在的结合位点。构建具有microRNA-210预测结合位点的野生型双荧光素酶报告质粒和突变型双荧光素酶报告质粒，将microRNA-210 mimic，microRNA-210 inhibitor，mimiccontrol，inhibitor control转染到退变椎间盘髓核细胞中，双荧光素酶检测系统检测荧光活性。(2)将ATG7 siRNA和microRNA-210 inhibitor转染髓核细胞，分四组:A组.microRNA-210 inhibitor（-）,ATG7siRNA(-);B组.microRNA-210 inhibitor（-），ATG7 siRNA(+);C组.microRNA-210 inhibitor(+),ATG7 siRNA（-）;D组.microRNA-210 inhibitor(+)，ATG7 siRNA(+)。qRT PCR和western blot检测Ⅱ型胶原，蛋白多糖，基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的mRNA表达量。　　结果:(1)通过TargetScan预测分析发现，ATG7的3'UTR与microRNA-210存在结合位点。上调microRNA-210表达会显著降低野生型双荧光素酶报告质粒荧光活性，突变型双荧光素酶报告质粒荧光活性未发生明显改变;下调microRNA-210表达会显著增加野生型双荧光素酶报告质粒荧光活性，突变型双荧光素酶报告质粒荧光活性未发生明显改变。(2)敲除ATG7会导致Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达量降低，基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达量升高;敲除ATG7会减弱下调microRNA-210引起的Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达量升高，基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达量降低的现象。　　结论:microRNA-210直接与靶基因ATG7的3'UTR结合;microRNA-210通过沉默ATG7抑制细胞自噬促进髓核细胞外基质降解。

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声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分：人退变椎间盘组织中自噬水平以及microRNA-210表达水平的改变

实验试剂及仪器

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分：microRNA-210通过调节髓核细胞自噬影响髓核细胞外基质代谢

实验试剂及仪器

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分：ATG7为microRNA-210的靶基因并参与退变髓核细胞外基质代谢

实验试剂及仪器

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

文献综述microRNA在椎间盘退变中的研究进展

攻读学位期间发表论文情况

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