靶向GPC3的CAR--NK细胞在肝细胞肝癌免疫治疗中的研究

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在世界范围内是排名第二位的癌症死因，中国肝癌发病人数和因病致死人数占全世界的50％以上，病死率居第三位。尽管目前HCC治疗方案呈现多样化、联合化的趋势，但实际上近10年来HCC患者的长期生存已很难再获得更进一步改善。因此，迫切需要找到一种全新的有效安全的治疗手段。近年来，嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞是最受关注的肿瘤免疫疗法之一，该技术通过在T细胞中转染嵌合抗原受体，使T细胞可以特异性靶向肿瘤表面抗原，同时胞内段结构域可以提供第一和第二信号活化T细胞，使其成为具有精确靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术，在多种肿瘤中特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出了极佳的疗效。但与此同时，安全性也成为困扰CAR-T临床应用的一大难题:细胞因子风暴、脱靶效应、严重的过敏反应和神经毒性，以及病毒载体带来的安全隐患严重限制了CAR-T的进一步推广。　　NK细胞是固有免疫系统中重要的效应细胞。NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性，且不受MHC限制性;成熟的NK细胞不分泌IL-6，体内存活周期短，不引起GVHD反应。骨髓移植中的研究表明，血液系统肿瘤可有效被同种异体的NK细胞识别和杀伤，NK治疗可显著增加疾病控制并降低复发率。但许多肿瘤细胞常通过表达非经典HLA I类分子、表达免疫抑制性配体、分泌免疫抑制性因子等方式获得免疫逃逸的能力，NK过继性治疗的临床表现不佳。所以在NK细胞中引入嵌合抗原受体修饰，引导NK细胞对肿瘤细胞靶向杀伤成为改进NK过继性治疗的重要策略。　　基于此，我们在本课题研究中采用TCGA数据揭示了肝癌特异性抗原GPC3，通过噬菌体抗体展示技术筛选获得了GPC3的高亲和力的特异性抗体;基于NK细胞的活化信号对CAR进一步优化，筛选获得了适用于NK的CAR结构;最后对CAR-NK临床研究应用中的重要技术进行了探索，建立了提高NK细胞扩增能力和细胞毒活性的脂质体feeder，并建立了基于HCC患者循环肿瘤细胞的PDX模型。　　第一部分:肝细胞肝癌肿瘤抗原的筛选、表达与抗体筛选　　首先我们对TCGA数据库中的肝癌样本进行差异分析，结果表明有多个基因在肝癌中显著上调，其中GPC3是最显著的一个。结合Human protein atlas数据库中的数据，GPC3在其他正常组织中几乎不表达，说明GPC3是一个HCC治疗的良好靶点，在靶向治疗过程中几乎不会引起其他正常组织的损伤。随后我们对GPC3的理化性质进行分析，结果表明GPC3羧基端亚基分布了更多的β转角和无规则卷曲，适合作为抗原免疫动物。我们在CHO系统中表达纯化了GPC3羧基端亚基△GPC3，并免疫动物后构建了噬菌体抗体展示文库，通过淘洗该文库我们共获得3株抗体:QX6.3F、QX1.11A、QX2.6C，其中亲和力最高的QX6.3F抗体Kd约为20nM，且具有良好的特异性。　　随后，我们分析了GPC3在HCC细胞系中的表达情况，经过分析公共数据库中的测序/芯片数据并结合qPCR/Western-Blot验证，我们筛选到HepG2和Hep3B典型的GPC3阳性细胞，SMMC-7721与QYG-7703为典型的GPC3阴性细胞。此外我们通过FACS分选和CRISPR/Cas9系统分别构建了对应的GPC3敲除细胞系或过表达细胞系，以及相应的Luciferase稳转细胞系。　　第二部分:自然杀伤细胞中CAR结构的优化　　目前临床中所使用的CAR-NK中嵌合抗原受体结构主要沿用了第二代和第三代CAR-T结构，并未针对NK细胞特有的活化信号进行优化。在本部分中我们开展了CAR的胞内段和跨膜区的优化工作，并将GC33、YP7和QX6.3F序列作为scFv结构域整合到嵌合抗原受体结构中，对其杀伤效果进行了验证。　　在胞内段优化过程中，我们选取了CD137、2B4、DNAM1、CD3ζ、DAP10、DAP12的胞内段活化结构域串联，作为CAR的胞内段结构域(CARMax)。建系后，将其杀伤效率与T-CAR进行比较。结果表明CARMax可以显著提高NK-92对HepG2、Hep3B细胞以及过表达GPC3后SMMC-7721、QYG-7703细胞的杀伤活性。然后逐一缺失上述结构域，结果表明CD137结构域对CAR的活性影响较小，可以去除。　　在跨膜区优化过程中，我们选取了具有活化NK作用的NKp44和NKG2D跨膜区序列对嵌合抗原受体进行优化。NKp44跨膜区富含带有正电荷的赖氨酸，可与胞浆区带有负电荷的DAP12结合，而NKG2D可与DAP10分子结合传递活化信号。将不同的CAR建系后检测其对HepG2的杀伤活性，结果表明使用NKp44跨膜区可以进一步提高CAR-NK的杀伤活性。鉴于NKp44跨膜区可以介导DAP12的信号活化，之后我们探讨了是否可以在胞内段结构域中去除DAP12结构，结果表明跨膜区替换为NKp44后，胞内段是否含有DAP12结构对CAR的杀伤活性无显著影响。　　最后我们根绝斯隆-凯特琳癌症中心Michel Sadelain团队的研究结论对CAR结构进一步简化。结果表明ITAM基序靠近跨膜区可以进一步提高NK细胞活化比例与IFN-γ分泌。此外CD3ζ中的3个ITAM非NK细胞活化所必须，只保留第一个ITAM即可很好的维持CAR的生理功能。至此，通过三轮筛选我们获得了NK细胞中最佳的CAR结构:scFv-NKP44TM-CD3ζ△1-2B4-DNAM1-DAP10。我们研究了该结构相比于T-CAR在信号转导中的优点，结果表明相比T-CAR，CARopti中激酶Fyn的磷酸化水平显著上调，进而介导了PLC-γ1和PLC-γ2的活化;CARpti可上调Syk磷酸化水平，介导更强的Vav和ERK1/2的活化;CARopti可促进了IKKα/β的活化，进而激活IκB，从而促进了p65的磷酸化;CARpti也可轻度促进了PI-3K p85亚基的活化，进而介导了AKT途径的活化增强。　　我们验证了第三方GPC3抗体GC33、YP7和自研抗体QX6.3F对HepG2的杀伤活力差异，结果表明基于QX6.3F与GC33构建的CAR-NK杀伤活性无显著差异。为了进一步提高细胞的安全性，在细胞中转入了AP1903诱导的自杀基因，该细胞系经pmol/L数量级的AP1903即可显著诱导凋亡，且在小鼠体内高剂量（5.0×107cell/小鼠）细胞注入小鼠体内是安全的。　　第三部分:提高NK细胞增殖及杀伤能力的新方案探索与基于循环肿瘤细胞PDX模型的建立　　提高并在体内维持免疫治疗中回输细胞的活力是目前过继性免疫治疗的一大难题。AR-NK进入机体后周围环境细胞因子匮乏，其活性会发生显著下降。在低浓度细胞因子状态下维持CAR-NK的活力最有效的办法是使用Feeder细胞。但目前常见的饲养细胞K562是悬浮生长的肿瘤细胞，进入人体有潜在的成瘤风险。基于此，我们根据NK的K562Feeder细胞开发出了Feeder脂质体。我们在脂质体中掺入了神经节苷脂GM2，使用链霉亲和素偶联的GM2单链抗体连接至脂质体表面形成挂载中心。随后将生物素化偶联的IL-21、IL-15和4-1BBL与脂质体共孵育即可形成Feeder脂质体。　　CAR-NK临床应用中的另一大问题是如何选择合适的病人。因此我们建立了一种基于温敏型生物凝胶悬滴培养肝癌循环肿瘤细胞，进而体内种植成瘤的PDX模型，通过该培养体系，可以体外对肝癌患者的循环肿瘤细胞进行扩增，并形成多细胞克隆，挑取该克隆接种裸鼠可以在皮下、肝内即可形成肿瘤，建成异种移植瘤模型。　　结合上述三部分的研究，我们从肿瘤抗原筛选、抗体研发开始建立了完整的靶向GPC3的CAR-NK体系，并根据NK细胞的生物学特性构建了NK专用的CAR结构，最后通过转染自杀基因保证临床安全、构建Feeder脂质体提高NK体内活性、建立HCC-PDX模型用于适应症筛选，组成了完整的CAR-NK细胞治疗系统，为进一步研究靶向GPC3的CAR-NK细胞治疗肿瘤提供了实验基础及数据。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

1．癌症患者的自然杀伤细胞

2．基于自然杀伤细胞特性的癌症免疫疗法

3．自然杀伤细胞过继性免疫治疗

第一部分 肝细胞肝癌肿瘤抗原的筛选、表达与抗体筛选

一、实验方法和材料

二、实验结果

(一)肝细胞肝癌肿瘤特异性抗原的筛选

(二)GPC3结构与理化性质分析

(三)抗体亲和力与特异性分析

(四)GPC3于HCC细胞系中的表达检测及相关敲除／过表达细胞系构建

(五)干预GPC3表达对细胞生长的影响

第二部分自然杀伤细胞中CAR结构的优化

一、实验方法和材料

二、实验结果

(一)NK细胞CAR胞内结构域优化

(二)NK细胞CAR跨膜区优化

(三)CAR结构的进一步优化

(四)CARopti介导的信号通路活化研究

(五)GC33／YP7／QX6．3F-CARopti的杀伤活性比较

(六)QX6．3F-CARopti-NK92体内杀伤活性研究

(七)QX6．3F-CARopti-NK92稳转自杀基因建系

第三部分提高NK细胞增殖、杀伤能力的新方案探索与基于循环肿瘤细胞PDX模型的建立

一、实验方法和材料

二、实验结果

(二)HCC-CTC体外悬滴培养与CTC-PDX模型建立

分析与讨论

参考文献

文献综述 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3——肝癌诊断与治疗的新靶点

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢