基于液相-串联质谱联用技术的靶向氨基酸代谢组学发现结直肠癌诊断的生物标志物

摘要

结直肠癌，又称大肠癌，为消化系统常见的恶性肿瘤，近十年来国内结直肠癌原发病率和年龄标准化发病率均持续增长。结直肠癌潜伏期较长、生长较慢、进展缓慢，其诊断分期对于患者愈后有着较大的影响。及时的检诊可以有效提高结直肠癌的治疗效果并改善患者预后。目前结直肠癌的诊断方法主要为生化检验、影像学检查和病理学检查。由于缺乏敏感度和特异性较好的生物标志物，其早期诊断率仍然较低。而诊断金标准结肠镜检查不适合用于大规模人群的早期筛查。因此，探索有效诊断结直肠癌的生物标志物具有重要的意义。　　近十年来，随着多种组学技术的发展，新型的生物标志物得以发现。作为组学的一个分支，代谢组学能够检测细胞信号转导、调节以及生物化学反应中的小分子物质，具有较高的敏感度和特异性。代谢组较目前临床使用的生物标记物更为敏感，对人体内任何微小的生化改变具有很强的监测能力，因而可以成为包括结直肠癌在内各种癌症的诊断和个性化治疗最有力的工具之一。基于代谢组学发现结直肠癌的肿瘤生物标志物，具有无创或微创、适合大规模人群筛查的优点，且用于分析的血浆和尿液等体液样本使用量少，容易获得。　　氨基酸在机体新陈代谢中起着至关重要的作用，是维持正常细胞功能和生物生存的必需。氨基酸的组成与含量随着肿瘤细胞代谢的改变而产生变化，因此在一定程度上能够反映原发肿瘤的形成、生长和浸润转移等情况。在结直肠癌代谢组学研究中，已有文献报道结直肠癌患者和健康志愿者的血液、尿液和粪便中氨基酸的组成不同，在癌组织与正常组织之间的氨基酸组成也存在一定的差异性。　　基于以上因素，首先，本论文建立了结直肠癌患者癌组织中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、门冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸（Arg）、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、门冬酰胺(Asn)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸（Trp）、半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、瓜氨酸(Cit)、非对称二甲基精氨酸(ADMA)、胱氨酸(Cyss)、肌氨酸(Sar)、3-氨基丙酸(Apa)、3-氨基-2-甲基丙酸(Amp)、4-氨基丁酸(Aba)、5-氧代-脯氨酸(Opr)、羟脯氨酸(Hpr)、鸟氨酸(Orn)、2-氨基己二酸(Ahd)、马尿酸(Hia)、对称二甲基精氨酸(SDMA)、犬尿氨酸(Kyn)等34种氨基酸的液相-串联质谱联用（LC-MS/MS）检测方法，该方法仅需要100mg组织样本匀浆，避免了对待测氨基酸进行衍生化处理，且10min内完成分析，检测选择性好，34种待测氨基酸及内标氨基酸具有较好的色谱分离与质谱响应，标准曲线在线性范围内线性良好，提取回收率与基质效应、定量下限、日内日间准确度精密度、稳定性、稀释效应均符合生物样本分析要求，适用于临床大批量组织样本的高通量分析。　　运用该方法对94例结直肠癌患者癌组织、癌旁组织及正常组织样本进行34种氨基酸的含量测定，并进行结直肠癌组织靶向氨基酸代谢组学研究。结果表明:癌组织中Gly、Asp、Glu、Pro、Cys、ADMA、Cyss、Kyn、Orn、Aba、Apa、Hpr，以及Ala、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Asn、Met、Trp、His、Opr、SDMA、Sar、Amp含量均显著高于癌旁组织、正常组织中的含量;结直肠癌组织与非癌组织的氨基酸代谢谱具有较大差异;建立的正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)模型具有较高的稳定性和较高的预测率，能够较好的区分癌组织与非癌组织;找到了Apa、Kyn、Cyss、Cys、Hpr、ADMA、Gly、Asp、Ala、Val、His十一个变量投影重要性(VIP)值大于1的差异性代谢物，其中VIP值大于1.5的差异性代谢物有Apa、Kyn、Cyss，可以作为潜在的区分肿瘤组织的生物标志物。　　其次，本论文建立了结直肠癌患者血浆中Gly、Ala、Val、Lys、Leu、Ile、Gln、Glu、Met、His、Phe、Arg、Tyr、Trp、Ser、Pro、Thr、Opr、Asn、Orn、Cit、Cyss、Cys、Hpr、Asp、ADMA、SDMA、Kyn、Apa、Sar、Amp、Hia等32种氨基酸的LC-MS/MS检测方法，该方法中待测氨基酸不用衍生化，直接通过反相C18柱进行色谱分离，血浆用量仅50μl，分析时间10min，检测选择性好，在线性范围内各待测氨基酸的标准曲线线性良好，提取回收率与基质效应、定量下限、日内日间准确度精密度、稳定性、稀释效应均符合生物样本分析要求，适用于临床大批量血浆样本的高通量分析。　　运用该方法对246例结直肠癌患者血浆、411例健康志愿者血浆、33例结直肠癌前病变患者血浆进行32种氨基酸的含量测定，并进行结直肠癌血浆靶向氨基酸代谢组学研究。结果表明:结直肠癌患者血浆Gln、Ser、Glu、Asn、Opr、Orn、Lys、Cys、Amp、SDMA、Asp含量均显著高于健康志愿者血浆中的含量，Gly、Ala、Val、Phe、Trp、Pro、Arg、Met、Tyr、Cyss、His、Hia、Hpr、Sar、Apa、Leu、Kyn均显著低于健康志愿者血浆中的含量;结直肠癌患者血浆与健康志愿者血浆中的氨基酸代谢谱具有较大差异;建立的OPLS-DA模型具有较高的稳定性和较高的预测率，能够较好的区分结直肠癌患者与健康志愿者;找到了Trp、Sar、Glu、Ser、Met、Ala、Cys、Cyss、Tyr、Opr、Apa、Gln、Hia、Arg十四个VIP值大于1的差异性代谢物，其中VIP值大于1.5的差异性代谢物有Trp、Sar、Glu，可以作为潜在的诊断结直肠癌患者的生物标志物。通过Logistics回归，基于Trp、Sar、Glu三个氨基酸建立了联合因子诊断模型。诊断模型方程为:联合因子=0.001×Trp+0.029×Sar-0.002×Glu-9.427(Trp、Sar、Glu单位ng/ml)，联合因子截断值为2.433（小于截断值，诊断为结直肠癌患者）;对结直肠癌的诊断效能高于氨基酸单因子，高于临床常用的血清诊断指标癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白。该结直肠癌诊断模型对上述血浆样本的诊断准确率为91.9％、灵敏度为83.3％、特异性为96.6％、阳性预测值93.2％、阴性预测值91.3％，各项诊断评价指标均优于CEA诊断，可用于结直肠癌的辅助诊断。　　最后，本论文比较了154例结直肠癌患者与154例健康志愿者的血浆样本中Trp、Kyn含量，以及吲哚胺2，3-双加氧酶1（IDO1酶）的含量及相对活性，比较了94例结直肠癌患者的癌组织与癌旁组织、正常组织样本中IDO1酶的相对活性，结果表明:结直肠癌患者血浆IDO1酶含量略高于健康志愿者，但含量差异无统计学意义;结直肠癌患者血浆IDO1酶相对活性极显著高于健康志愿者;结直肠癌患者癌组织IDO1酶相对活性极显著高于癌旁组织、正常组织。研究初步证实了结直肠癌患者体内存在着色氨酸代谢紊乱的异常情况。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 课题研究背景

1．1 结直肠癌简介，以及流行病学现状

1．2 结直肠癌检诊、监测的重要意义，以及存在的问题

1．3 基于代谢组学研究肿瘤标志物的依据、方法及临床意义

1．4 结直肠癌氨基酸代谢组学的研究现状

2 课题研究意义

3 课题研究内容

第二章 结直肠癌组织氨基酸的液相-串联质谱联用检测方法的建立

1 引言

2 实验仪器与材料

2．1 仪器

2．2 试剂与耗材

2．3 氨基酸对照品

2．4 组织样本

3．1 相关溶液的配制及前处理

3．2 色谱条件

3．3 质谱条件

3．4 组织样本的前处理

3．5 方法学验证

3．6 数据处理

4 结果

4．1 方法学验证结果

4．2 组织样本测定结果

5 讨论

5．1 氨基酸对照品储备溶液的配制浓度

5．2 质谱条件的优化

5．3 “模拟组织液”的选择

5．4 组织样本前处理方法的确定

5．5 内标氨基酸的选定

6 小结

第三章 基于液相-串联质谱联用技术的结直肠癌组织靶向氨基酸代谢组学研究

1 引言

2 实验仪器与材料

2．1 仪器

2．2 试剂与耗材

3 液相-串联质谱联用检测方法

3．1 相关溶液的配制及前处理

3．2 色谱条件

3．3 质谱条件

3．4 组织样本前处理

3．5 数据处理及统计方法

4 结果

4．1 结直肠癌患者的基本信息

4．2 组织样本氨基酸总离子流图

4．3 组织样本氨基酸含量测定结果

4．4 组织样本氨基酸多维统计分析结果

5 讨论

5．1 结直肠癌组织氨基酸代谢谱的特点

5．2 靶向氨基酸代谢组学用于癌症分期研究的不足

6 小结

第四章 结直肠癌患者血浆氨基酸的液相-串联质谱联用检测方法的建立

1 引言

2 实验仪器与材料

2．1 仪器

2．2 试剂与耗材

2．3 氨基酸对照品

2．4 血浆样本

3．1 相关溶液的配制与前处理

3．2 色谱条件

3．3 质谱条件

3．4 血浆样本的前处理

3．5 方法学验证

3．6 数据处理

4 结果

4．1 方法学验证结果

4．2 血浆样本测定结果

5 讨论

5．1 血浆待测氨基酸种类的确定

5．2 分析条件的优化

5．4 内标氨基酸的选定

6 小结

第五章 基于液相-串联质谱联用技术的结直肠癌患者血浆靶向氨基酸代谢组学研究

1 引言

2 实验仪器与材料

2．1 仪器

2．2 试剂与耗材

2．3 氨基酸对照品

2．4 受试人员血浆样本收集

2．5 受试人员分组

3．5 数据处理及统计方法

4 结果

4．1 训练集人员基本信息

4．2 训练集血浆样本氨基酸总离子流图

4．4 训练集血浆样本氨基酸多维统计分析结果

4．5 结直肠癌诊断模型的建立

4．6 结直肠癌诊断模型的验证

5 讨论

5．1 结直肠癌患者血浆氨基酸代谢谱的特点

5．2 基于联合因子建立的结直肠癌诊断模型

5．3 测试集样本的选择及诊断模型的验证

6 小结

第六章 结直肠癌患者的色氨酸代谢通路

1 引言

2 IDO1酶含量

2．1 实验仪器与材料

2．2 检测方法

3．1 IDO1酶相对活性计算方法

3．2 数据处理及统计方法

3．4 组织IDO1酶相对活性计算结果

4 讨论

4．1 色氨酸代谢通路及IDO酶的作用及临床意义

4．2 结直肠癌组织色氨酸代谢发生改变的病因机制

4．3 其它差异性氨基酸在结直肠癌代谢改变中的意义

4．4 联合因子诊断模型对于结直肠癌诊断的优势

4．5 靶向氨基酸代谢组学研究的不足

第七章 研究总结及展望

1 研究总结

2 展望

参考文献

附录

文献综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢