芬太尼类失能剂的体内检测研究

摘要

失能剂是化学武器的一个分支，是指不会使敌方人员产生致命性损伤、仅使其丧失作战能力的一类战剂。其中，强效麻醉性镇痛药芬太尼类化合物因其易获取、起效快、施用方便，安全性已在临床应用中得到验证，目前已被作为一种新型失能剂使用，并有可能会成为失能剂未来研究的主要方向。但目前，芬太尼类失能剂在实战应用中并未达到满意效果，在2002年莫斯科剧院恐怖事件中大量人质吸入过量芬太尼类失能剂、且未被及时检出而耽误了救治，导致大量人员伤亡。因此，建立快速、灵敏的芬太尼类失能剂的体内检测方法，对于特殊情况下该类化合物的及时筛查和后续的医疗救治均具有重要意义。本研究以芬太尼、舒芬太尼为典型代表，系统开展了芬太尼类失能剂的体内检测研究:　　第一，研究建立了可同时分析大鼠血浆中芬太尼和舒芬太尼的HPLC-MS/MS方法，并从选择性、线性范围、提取回收率、基质效应、准确度与精密度等方面进行了系统的方法学验证。结果表明，本研究建立的LC-MS/MS方法分析时间短、操作简便，线性范围宽，准确度、精密度、重复性均良好，提取回收率可达82％以上，可满足对血浆样品中的芬太尼和舒芬太尼进行准确测定的要求，为相关工作的开展奠定了坚实基础。　　第二，为模拟失能剂化学袭击的情况，自行搭建了一种雾化给药装置，并分别对芬太尼和舒芬太尼气雾剂的浓度和用量进行了考察，发现当芬太尼和舒芬太尼雾化液的浓度分别为2000μg/mL和25μg/mL时，大鼠可出现中毒症状，并且失能剂浓度、用量与施用对象数量之间具有一定的相关性;同时，应用本研究建立的HPLC-MS/MS分析方法，测定了大鼠吸入给药后血浆样品中芬太尼和舒芬太尼的浓度变化规律，发现吸入给药以后，两种药物在大鼠体内的血药浓度均迅速升高，之后呈不断下降趋势，且大部分大鼠在240min以内仍可在血浆中检测到原型药物。　　第三，结合基于UPLC-Q/TOFMS的代谢组学研究手段，对芬太尼和舒芬太尼吸入给药后不同时间点的大鼠血浆的代谢组学特征进行了研究，并结合正交偏最小二乘法判别分析等数据分析方法，筛选出酪氨酸、肉碱、溶血磷脂酰胆碱、鸟氨酸、精氨酸等若干种因芬太尼、舒芬太尼吸入给药而发生显著变化的内源性生物标志物，表明芬太尼可能干预了酪氨酸-左旋多巴、磷脂酰胆碱-溶血磷脂酰胆碱等代谢通路，舒芬太尼可能干预了脂肪酸氧化、鸟氨酸-精氨酸等代谢通路。以上差异性内源性生物标志物的变化可为该类失能剂的施用提供间接佐证，从而为该类化合物的检测提供了一条新思路。　　第四，初步探索了采用TLC-SERS联用技术快速检测大鼠血浆中舒芬太尼的新方法，对不同展开剂、纳米银胶以及相关检测参数进行了选择和优化，以二氯甲烷-甲醇(9∶1.2)为展开剂，纳米银溶胶粒径为50nm，点胶量为5μL，积分时间为5s，将舒芬太尼的浓度与拉曼位移为1003cm-1的特征峰强度做线性回归，在0.2575-5.15μg/ml浓度范围内线性关系良好，回收率为86.62％-92.93％。采用该方法可检测出静脉注射给药(12.5-15μg/kg)后大鼠血浆中的舒芬太尼，且上述实测血浆中舒芬太尼的特征峰强度随给药剂量的增加而增加，说明采用本法可成功地在给药大鼠体内检测出舒芬太尼。本方法操作简便、分析时间短、特征性强，非常适用于对目标物进行现场快速检测。　　综上所述，本研究综合运用HPLC-MS/MS、TLC-SERS、代谢组学等现代分析手段，以芬太尼、舒芬太尼为典型代表，系统开展了芬太尼类失能剂的体内检测相关研究。建立了芬太尼、舒芬太尼的HPLC-MS/MS分析方法;基于自行搭建的模拟给药装置，分别考察了芬太尼和舒芬太尼气雾剂的浓度和用量，并获得吸入给药方式下芬太尼类化合物在体内的浓度变化规律;筛选出酪氨酸、肉碱、溶血磷脂酰胆碱等芬太尼、舒芬太尼显著干预的差异性内源性生物标志物，可为芬太尼失能剂的施用提供佐证，从而为该类药物的体内检测提供一条新思路;初步建立了生物样本中舒芬太尼的TLC-SERS快速检测方法，并成功地在给药大鼠体内检测出舒芬太尼。综上所述，本研究将为芬太尼类失能剂的筛查、快检及后续的医疗救治等提供有力的技术支撑，并为同类工作的开展提供有益参考。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章引言

一、课题背景介绍

(一)芬太尼类失能剂的研究现状

(二)生物样品中芬太尼类化合物分析的研究概况

(三)代谢组学在药物代谢研究中的应用

(四)薄层色谱．表面增强拉曼光谱联用技术(TLC-SERS)研究现状

二、本研究的内容与意义

(一)本课题研究的内容

(二)本课题研究的意义

第二章LC-MS／MS法同时测定大鼠血浆中芬太尼和舒芬太尼的方法学研究

一、实验材料与仪器

(一)药品与试剂

(二)仪器设备

(三)生物样品来源

二、实验方法

(一)溶液的配制

(二)动物给药及样品预处理

(三)LC-MS／MS分析条件

(四)方法学验证

三、讨论

(一)样品预处理方式的选择

(二)色谱条件的优化

(三)内标的选择

(四)质谱条件的优化

四、本章小结

第三章吸入给药装置研究及吸入给药后大鼠体内芬太尼和舒芬太尼的检测

一、实验材料与仪器

(一)药品与试剂

(二)仪器设备

(三)实验动物

二、实验方法

(一)吸入给药装置的搭建

(二)给药方案及样品采集

(三)样品测定

(四)数据分析

三、实验结果

(一)吸入给药装置相关参数的选择

(二)大鼠吸入给药后体内芬太尼和舒芬太尼的检测

四、讨论

五、本章小结

第四章结合代谢组学技术筛选芬太尼和舒芬太尼吸入给药后显著干预的内源性生物标志物

一、实验材料仪器

(一)药品与试剂

(二)仪器设备

二、实验方法

(一)样品预处理

(二)UPLC-MS分析条件

(三)数据分析与多变量统计分析

三、实验结果

(一)芬太尼吸入给药后大鼠体内的代谢组学特征

(二)舒芬太尼吸入给药后大鼠体内的代谢组学特征

四、讨论

五、本章小结

第五章TLC-SERS法用于大鼠血浆中舒芬太尼浓度的快速检测研究

一、实验材料与仪器

(一)药品与试剂

(二)仪器设备

(三)实验动物

二、实验方法

(一)银胶溶液的制备

(二)溶液的配制

(三)给药方案及样品采集

(四)样品预处理

(五)检测方法

(六)数据处理

三、实验结果

(一)动物实验

(二)TLC-SERS测定条件的优化

(三)舒芬太尼拉曼光谱特征峰的选定

(四)检测限的确定

(五)定量分析

四、讨论

五、本章小结

附录

参考文献

全文总结

发表论文情况

致谢