交感中枢β--arrestin1参与高血压心血管功能调控的机制研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：　　第一部分:β-arrestin1下调RVLM内AT1R改善高血压的作用机制研究　　研究目的：　　原发性高血压(Essential hypertension)是一种基因遗传性慢性疾病，也是人类最常见的心血管疾病之一，约占高血压患者数量的90％。高血压形成病因复杂，目前仍未完全清楚，虽然目前临床上治疗高血压的药物能够有效地控制大部分高血压的发展，但是高血压的并发症发生率仍居高不下，包括脑卒中、心力衰竭和肾脏损害等，因此对高血压形成和发病机制的深入探索仍具有重要的现实意义。交感神经活动亢进是高血压形成过程中一个重要的病理基础，并且和高血压病的预后有着极为紧密的联系。头端延髓腹外侧区（Rostral Ventrolateral Medulla，RVLM）是调控交感神经活动的关键中枢，在维持交感神经生理紧张性和血压平衡中具有十分重要的作用。研究表明，RVLM内血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)通过作用于血管紧张素Ⅰ型受体(Angiotensin type1receptor，AT1R)，激活G蛋白偶联信号通路，诱导炎症和氧化应激反应的途径，引起前交感神经元过度兴奋，最终导致交感神经活动亢进和高血压。因此，有效抑制AngⅡ-AT1R轴活性是防治高血压的重要策略之一。　　β-arrestin1是一种细胞内多功能调节蛋白，因介导G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)脱敏和内吞而被发现。本研究的第一个目的即明确RVLM内β-arrestin1对交感神经活动和血压的调节作用。β-arrestin1不仅是重要的GPCR调节蛋白，另有研究发现β-arrestin1可进入细胞核内调节NF-κB等多种转录因子，进而发挥基因表达的调控作用。AT1R是一种重要的GPCR，其基因表达同样受到NF-κB等转录因子调节，尽管β-arrestin1可介导AT1R脱敏和内吞，但是β-arrestin1对NF-κB和AT1R的基因表达调节作用仍不清楚。因此，本研究的第二个目的即明确RVLM内β-arrestin1对NF-κB和AT1R表达的调节作用。AT1R的功能与AngⅡ的效应密切相关，因此，本研究的第三个目的即探究β-arrestin1对AngⅡ-AT1R轴的调节作用及其在高血压心血管功能调控中的意义。　　基于上述研究背景，主要目的是明确中枢RVLM内β-arrestin1对高血压的调控作用和作用机制，为临床上更有效地防治高血压提供可靠的理论依据。　　研究方法：　　以体重为250g左右的成年（16周龄）雄性正常血压大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）和自发性高血压大鼠（Spontaneously hypertensive rat，SHR）为动物模型，通过大鼠RVLM内分别转染携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)和Arrb1基因的腺相关病毒(Adeno associated virus，AAV)过表达GFP和β-arrestin1，将大鼠分为四组:WKY+AAV-GFP,WKY+AAV-Arrb1，SHR+AAV-GFP,SHR+AAV-Arrb1。在麻醉状态下，观察四组大鼠基础血压和交感神经活动水平，并同时用Western Blot检测四组大鼠RVLM内NF-κB和AT1R的蛋白表达情况，用Q-PCR检测四组大鼠RVLM内AT1R的转录变化。利用免疫沉淀的方式检测过表达β-arrestin1后与IκBα的结合变化。最后通过β-arrestin1过表达后RVLM内急性微量注射AngⅡ，观察AngⅡ心血管效应的变化，以达到对AT1R功能的验证。　　研究结果：　　一、RVLM过表达β-arrestin1改善SHR高血压和交感神经活动亢进　　Western Blot检测WKY大鼠和SHR-RVLM内β-arrestin1的表达发现，其在SHR表达显著降低，且随着SHR年龄的增长，表达逐渐降低。通过RVLM内转染AAV-Arrb1结果发现，相比于SHR+AAV-GFP组，过表达β-arrestin1明显降低SHR的基础血压和肾交感神经活动[MAP(mmHg):168±3.95vs138±3.06;Baseline RSNA(％Max):31.8±1.52vs22.6±2.73,P＜0.05]。　　二、SHR-RVLM过表达-arrestin1降低NF-κB磷酸化和AT1R表达　　利用Western Blot检测四组大鼠RVLM内AT1R的蛋白表达水平，结果发现，相比于SHR+AAV-GFP组，过表达β-arrestin1明显降低SHR的AT1R表达，降幅约66％，与此同时，NF-κB和IκBα磷酸化水平也因过表达β-arrestin1而显著降低，降幅分别约66％和76％。为了进一步探究β-arrestin1调节NF-κB的作用机制，通过免疫沉淀的方法发现β-arrestin1过表达后与IκBα的结合增多，提示可能通过该相互作用抑制IκBα的磷酸化，进而限制NF-κB的活化，从而抑制NF-κB对AT1R基因的促转录活性。　　研究结论：　　RVLM内过表达β-arrestin1可改善交感神经活动亢进和高血压，通过抑制NF-κB活性下调AT1R表达，并且有效抑制AT1R的功能，发挥抗高血压的效应。　　第二部分:β-arrestin1增加RVLM内NO释放改善高血压的作用机制研究　　研究目的:　　一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一种重要的神经调质，也是一种重要的心血管功能调节分子，在调节神经元活性和舒张血管中发挥着重要的生理作用。NO在心血管中枢对神经元兴奋性的生理和病理调节中发挥了重要的作用。研究发现β-arrestin1通过AKT偏向性信号通路激活大隐静脉内皮细胞的eNOS活性，促进NO生成增多。而且β-arrestin1可通过抑制iNOS活性，减少胃黏膜细胞凋亡，降低门静脉高压。本部分的主要目标是明确RVLM内β-arrestin1对nNOS来源的NO的调节作用，以及在参与β-arrestin1改善高血压中的作用。　　在β-arrestin1偏向性信号通路中，ERK1/2是最经典的信号分子之一，在参与细胞内信号传导和调节细胞生理功能中扮演了十分重要的角色。但是β-arrestin1激活的ERK1/2信号通路在nNOS来源NO调节中的作用尚未明确，因此本部分的第二个研究目的是明确β-arrestin1偏向性ERK1/2信号通路对nNOS及其来源NO释放的作用，以及其在参与β-arrestin1改善高血压中的作用。　　研究方法:　　实验动物种系、年龄和体重均与第一部分相同。通过组织总NO试剂盒和总NOS活性试剂盒检测过表达β-arrestin1对RVLM内NO和NOS活性的影响。通过Western Blot检测过表达β-arrestin1后RVLM内nNOS和ERK1/2磷酸化(p-ERK1/2)水平，利用免疫荧光检测p-ERK1/2在RVLM的表达量。接下来构建SHR体内ERK1/2小干扰RNA(ERK1/2 siRNA)，随机干扰序列作为对照组(CON siRNA)将其在过表达β-arrestin1时转染至RVLM内，动物分为四组:AAV-GFP+CON siRNA，AAV-GFP+ERK1/2siRNA, AAV-Arrb1+CONsiRNA, AAV-Arrb1+ERK1/2siRNA。观察四组大鼠转染后的基础血压和肾交感神经活动的变化。最后检测四组大鼠RVLM内NOS活性和NO含量的变化以及nNOS磷酸化的表达变化。　　研究结果:　　一、过表达β-arrestin1显著增加SHR-RVLM内nNOS磷酸化和NO释放　　通过组织总NO试剂盒和NOS活性试剂盒检测过表达β-arrestin1后RVLM内NO含量和NOS活性的变化，结果发现，相比于SHR+AAV-GFP组，SHR+AAV-Arrb1组大鼠NO含量和NOS活性明显增加，增幅约1.0和1.6倍。同样地，通过WesternBlot发现nNOS的磷酸化水平也明显增加，增幅约2.8倍，而eNOS的磷酸化水平并未发生明显变化。　　二、 ERK1/2偏向性信号通路介导β-arrestin1改善高血压以及nNOS来源的NO释放　　利用小干扰体内转染的方式抑制ERK1/2活性，观察其对β-arrestin1调节血压和nNOS磷酸化的影响，结果发现，相比于Arrb1+CON siRNA组，Arrb1+ERK1/2 siRNA组大鼠的基础血压和肾交感神经活动发生明显的增加[Baseline MAP(mmHg):145±2.6 vs169±4.1;Baseline RSNA(％Max):19.7±1.3 vs31.1±3.2，P＜0.05]。与此同时，nNOS的磷酸化水平被显著抑制，抑制率约76％, NO的释放也显著降低，降幅约41％。　　研究结论:　　RVLM内过表达β-arrestin1通过增加nNOS磷酸化及其来源的NO释放改善高血压，该作用是由ERK1/2偏向性信号通路介导的。本研究在中枢β-arrestin1与nNOS之间搭上了重要的桥梁，为β-arrestin1偏向性信号通路防治原发性高血压提供了重要的理论支持。

目录

声明

摘要

中英文缩写对照表

第一部分：β-arrestin1下调RVLM内AT1R改善高血压的作用机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

第二部分：β-arrestin1增加RVLM内NO释放改善高血压的作用机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

综述

在读期间科研成果

致谢