益气醒脑口服液的制备工艺及其对缺血性脑卒中的作用研究

摘要

益气醒脑口服液（以下简称“益气醒脑”）是以中医经典名方补阳还五汤化裁而来，由黄芪，川芎，红花，桃仁，丹参等11味中药组成。益气活血、醒脑开窍，用于中风病的中经中络证（即缺血性脑卒中）的急性期、恢复期、后遗症期。目前以院内制剂的形式在临床用于缺血性脑卒中患者，疗效显著。但该制剂存在制备工艺较为落后，系统药效学研究缺乏，作用机制尚不明确等问题。鉴于此，本研究通过正交设计优化益气醒脑制备工艺；利用大鼠大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion， MCAO）缺血再灌注损伤实验和家兔对照实验，进行药效学研究，并从细胞凋亡、血脑屏障通透性和清除自由基的角度研究其可能的作用机制。主要内容如下：　　第一部分 益气醒脑制备工艺的研究与制剂稳定性考察　　以加水量、提取时间、提取次数、醇沉浓度设计 L9（34）正交实验，以脑梗死体积减少比、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量、口服液澄明度为考察指标，得到益气醒脑口服液最优提取工艺为：加12倍量水（液料比），提取时间1 h，提取次数3次，醇沉浓度60%。　　通过3批样品验证，在优化工艺下，大鼠脑梗死体积较模型组明显减少（P＜0.05），毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均含量为155.8 μg/mL，性状符合要求。与原工艺相比，优化工艺在毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量与液体澄明度得到提升。光照实验、加速实验和长期实验证明优化后的工艺制备的益气醒脑稳定性良好。　　第二部分 益气醒脑对缺血性脑卒中的药效学研究　　在大鼠大脑MCAO缺血再灌注损伤实验中，脑缺血2 h再灌注24 h后：益气醒脑低（P＜0.05）、中（P＜0.01）、高（P＜0.01）剂量组大鼠神经功能学评分与模型组比较显著降低；脑组织氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）染色结果显示，益气醒脑低（P＜0.05）、中（P＜0.01）、高（P＜0.01）剂量组大鼠脑梗死体积分别为25.36 ±4.41%、21.19 ±3.63%、13.42 ±4.68%，较模型组31.31 ±6.73%，明显减少；组织病理结果表明益气醒脑各剂量组均能改善大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织病变情况，病理评分较模型组均明显降低（低、中、高，P＜0.01）。　　在家兔血液流变学、凝血系统和血液纤溶及血栓形成实验中：益气醒脑中、高剂量组家兔在低、中、高三个切变率下全血粘度与自身给药前和对照组给药后相比，均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；益气醒脑低剂量组与对照组给药后（7d）比显著降低（P＜0.01），但与自身给药前（0d）比差异无统计学意义（P＞0.05）；各组血浆粘度和红细胞压与自身给药前（0d）和对照组（7d）比较，均无显著改变（P＞0.05）；与自身给药前（0d）和对照组给药后（7d）比，益气醒脑低、中、高剂量组家兔凝血系统中活化部分凝血活酶时间（Aactivated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶时间（Thrombin time，TT）、凝血酶原时间（Prothrombin time，PT）均显著延长（P＜0.05或 P＜0.01）；血液纤溶系统中纤维蛋白溶酶原（Plasminogen，Plg）含量均显著降低（P＜0.01），优球蛋白（Euglobulin lysis time，ELT）均显著缩短（P＜0.01），纤维蛋白原降解产物（Fibrin-ogendegradation products，FDP）水平均显著增加（P＜0.01）；益气醒脑低、中、高剂量组对家兔血栓抑制率分别为 21.79%、27.57%、33.11%，具有显著性差异（P＜0.01）。　　第三部分 益气醒脑口服液对再灌注损伤的机制初探　　采用末端标记（Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase MediateddUTPNick End Labeling，TUNEL）法检测脑组织细胞凋亡，益气醒脑低、中、高剂量组脑组织细胞凋亡率与模型组比显著减少（P＜0.05）。蛋白质免疫印迹法（Western blot，WB）和实时荧光定量法（real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，Q-PCR）检测结果表明益气醒脑各剂量组均可提升血管表皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor， VEGF）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）及VEGF信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）、Bcl-2 mRNA表达水平（P＜0.05）。同时，益气醒脑低、中、高剂量可提升脑组织中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的含量（P＜0.05），降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量（P＜0.05）。　　综上所述，益气醒脑对缺血性脑卒中具有改善再灌注损伤、降低全血粘度、抑制凝血系统活性、促进血液纤溶系统活性和抗体内血栓形成的作用，且效应与剂量呈线性关系；其作用机制与抑制细胞凋亡、保护血脑屏障通透性和清除体内过量自由基有关。

目录

声明

缩略词表

前言

一、脑卒中的简介与国内外研究现状

二、缺血性脑卒中的临床治疗

1、西医治疗

2、中医治疗

三、益气醒脑立方依据

四、本研究拟解决的问题

第一部分 益气醒脑的制备工艺研究与制剂稳定性考察

第一节 益气醒脑制备工艺的优化和验证

（一）材料与仪器

（二）实验方法

（三）实验结果

第二节 益气醒脑稳定性考察

（一）材料与仪器

（二）实验方法

（三）实验结果

第三节 讨 论

本章小结

第二部分 益气醒脑对缺血性脑卒中的药效学研究

第一节 益气醒脑对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用

（一）材料与仪器

（二）实验方法

（三）实验结果

第二节 益气醒脑对家兔血液流变学、凝血系统和血液纤溶及血栓形成的影响

（一）材料与仪器

（二）实验方法

（三）实验结果

第三节 讨 论

（一）缺血再灌注损伤动物模型

（二）实验药物给药剂量的设置和阳性对照药的选择

（三）益气醒脑对脑缺血再灌注损伤疗效观察

（四）益气醒脑对家兔血液流变学的影响

（五）益气醒脑对家兔血栓形成及血液纤溶和凝血系统相关参数指标的影响

本章小结

第四部分 益气醒脑对脑缺血再灌注损伤的保护机制初探

（一）材料与仪器

（二）实验方法

（三）实验结果

第二节 讨 论

（一）细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤

（二）血脑屏障通透性与脑缺血再灌注损伤

（三）自由基与脑缺血再灌注损伤

本章小结

全文总结

参考文献

在读期间发表的文章

致谢