肝脏ChREBP对果糖代谢的调节作用及机制研究

摘要

随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，肥胖、糖尿病、脂肪肝和高血脂等代谢性疾病的患病率在全球范围内呈现快速上升的趋势。这些代谢性疾病往往相互影响、伴随发生，以代谢综合征的形式出现，进一步发展为高血压、动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病，严重危害人们的身心健康和社会发展。近十几年来，我国肥胖与糖尿病的发病率逐年升高、并呈低龄化趋势。代谢性疾病及其相关心血管疾病已经成为我国公共卫生领域的重大挑战，也是重大慢性疾病防控的重中之重。　　大量的流行病学资料和实验研究表明，果糖摄入过量可能是导致代谢性疾病发病率升高的重要因素。碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)是调节葡萄糖和果糖代谢的重要转录因子。已有的研究发现ChREBP作为多种类型细胞中重要的代谢协调分子，能够对环境和激素信号作出反应，调节糖酵解和脂质合成，在健康和疾病状态下都具有广泛的影响。但是目前关于ChREBP的研究大都是基于全身敲除小鼠模型、siRNA干扰或者腺病毒过表达的实验体系，很难明确不同组织中ChREBP的具体功能。作为调节果糖代谢的关键性转录因子，ChREBP调节果糖代谢的细胞和分子机制尚不清楚。肝脏作为糖脂代谢的重要器官，肝细胞表达的ChREBP在果糖代谢和果糖耐受中的作用及其相关机制也不明确。　　为解析肝脏ChREBP的代谢调节作用，我们首先利用Cre/loxP重组酶系统，建立ChREBP的肝脏特异性基因敲除小鼠模型。利用qRT-PCR和Western Blot验证了在肝脏中ChREBP敲除的特异性和敲除效率，结果显示ChREBP只在肝脏中被敲除，在其他组织的表达不受影响，成功建立了肝脏特异性ChREBP敲除(ChLO)小鼠模型。然后我们利用ChLO小鼠模型，系统研究了肝脏ChREBP在糖脂代谢中的作用，以及在高蔗糖和高果糖饮食引起的糖脂代谢紊乱中的病理性作用及其机制。主要研究结果可分为以下三个方面:　　一、ChREBP参与维持肝脏糖原稳态　　在常规饮食情况下，肝脏ChREBP的缺失不影响小鼠的体重和血糖水平，也不影响小鼠全身的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。ChLO小鼠肝细胞形态正常，没有出现明显的肝损伤，并且肝脏脂质含量也没有明显改变。但是，ChLO小鼠的肝脏糖原含量升高了2倍，而骨骼肌糖原含量没有显著变化，表明ChREBP在调节肝脏糖原稳态中具有重要的生理作用。　　二、肝脏ChREBP减轻高蔗糖诱导的脂肪肝　　在高蔗糖饮食情况下，ChLO小鼠肝脏脂质累积明显增加。经过分析肝脏脂代谢的各个环节，发现ChLO小鼠肝脏脂肪酸从头合成能力降低、肝脏脂肪酸摄取能力降低、肝脏脂肪酸β氧化能力未发生改变、肝脏脂质分泌能力降低。因此，推测ChLO小鼠肝脏脂质累积增加是由于肝脏脂质分泌能力受损所致。进一步分析肝脏脂质分泌相关蛋白表达发现，肝脏ChREBP的缺失导致脂质分泌的关键分子MTTP的mRNA和蛋白表达降低。　　三、肝脏ChREBP保护小鼠免受高果糖诱导的糖原性肝病　　在高果糖饮食情况下，肝脏ChREBP的缺失不影响小鼠的体重和血糖水平。但是ChLO小鼠出现严重的肝损伤、肝脏肿大和肝脏糖原累积，同时未出现明显的炎症反应、内质网应激和凋亡现象。这些结果说明ChLO小鼠在高果糖饮食情况下出现糖原累积而导致糖原性肝病。我们通过饥饿/重喂食实验证明ChLO小鼠肝脏糖原累积是由于糖原合成增多而非糖原降解减少所致。肝脏蛋白表达和代谢产物含量分析结果显示，ChLO小鼠肝脏糖原合成增多与肝脏G-6-P含量升高而导致糖原合成酶活性增强有关。在进食状态下，ChLO小鼠肝脏ATP含量明显降低，并在高果糖饮食情况下，ChLO小鼠肝脏ATP含量的降低进一步加剧。而在饥饿状态下，ChLO小鼠肝脏ATP含量跟对照小鼠相比没有明显差别。通过饥饿/重喂食实验证明，ChLO小鼠肝脏ATP含量降低开始于肝脏糖原累积之后。这说明可能是由于糖原过度合成消耗大量的ATP导致了ChLO小鼠肝脏ATP含量的降低。同时ChLO小鼠肝脏线粒体数量、线粒体氧化磷酸化蛋白表达和原代肝细胞线粒体呼吸功能未发生改变。　　我们进一步分析了参与果糖代谢相关基因的表达，发现在正常对照小鼠中，肝脏LPK对果糖的反应性最强，高果糖刺激可导致肝脏LPK表达水平大幅上调，而ChREBP的其他靶基因，如Khk、Aldob、Fbp1和G6pc对果糖的反应性则较差。ChREBP的缺失导致肝脏LPK的mRNA和蛋白表达都明显降低，然而Khk、Aldob、Fbp1和G6pc的表达受到的影响则很轻微。这些结果提示LPK可能是控制肝脏中果糖代谢和果糖耐受的关键蛋白。我们利用制备的LPK过表达腺病毒进行LPK的肝脏回补实验，结果发现LPK在肝脏中的过表达能够在很大程度上逆转ChLO小鼠在高果糖饮食情况下出现的肝脏肿大、肝脏糖原累积、肝脏ATP缺乏和血浆转氨酶升高的表型。　　综上，我们利用ChLO小鼠模型得出如下结论:(1)肝脏ChREBP通过调节MTTP表达，在肝脏脂代谢稳态中发挥重要作用。在高蔗糖饮食情况下，ChREBP能够促进肝脏MTTP表达从而增强其脂质分泌能力，以此来减轻高蔗糖饮食诱导的肝脏脂质累积。我们的研究发现肝脏ChREBP能够通过调节肝脏脂质分泌而影响肝脏脂代谢稳态。(2)肝脏ChREBP通过调节LPK表达，在果糖代谢和果糖耐受中发挥重要作用。在果糖刺激下，ChREBP能够激活LPK表达而增强糖酵解通路，促进果糖代谢产物进入糖酵解而增加ATP的产生，以此来克服果糖诱导的糖原累积、ATP缺乏和肝脏损伤。我们的研究明确了肝脏ChREBP在果糖代谢和果糖耐受中的关键作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、非酒精性脂肪肝病

二、糖原代谢的调节

三、果糖代谢

四、调节果糖代谢的转录因子-ChREBP

三、ChREBP特异的靶基因-丙酮酸激酶

材料与方法

一、实验动物

二、主要实验试剂

三、主要试剂配方

四、实验方法

实验结果

第一部分肝脏特异性ChREBP敲除小鼠模型的建立与表型分析

第二部分肝脏ChREBP减轻高蔗糖诱导的脂肪肝

第三部分肝脏ChREBP保护小鼠免受高果糖诱导的糖原性肝病

讨论

一、ChLO小鼠模型的建立与表型分析

二、肝脏ChREBP减轻高蔗糖诱导的脂肪肝

三、肝脏ChREBP保护小鼠免受高果糖诱导的糖原性肝病

全文总结

参考文献

文献综述

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢