基于免疫脂质体的生物传感器在体外诊断中研究及其应用

摘要

体外诊断(In vitro diagnosis，IVD)是一种在人体之外检验样本（血液、体液、组织）而进行疾病或身体功能的诊断方法。生物传感器(Biosensor)是在生命科学和信息科学之间发展起来的一类特殊传感器，在多种学科的融合和交叉下形成的，包括医学、纳米技术、信息学和化学等等，在食品检测、活体成像、临床应用上有巨大的作用，是目前国内外关注的热点研究。目前临床上对于各类标记物的检测方法普遍存在操作繁琐、检测时间长、需要特殊场地、大型设备及专业人员等因素制约，因此开发高灵敏度、简便、快速、适用于复杂环境并利于临床推广的生物传感技术迫在眉睫。蛋白质是生物体中必不可少的生物分子，涉及广泛的生物学功能。其异常表达是常与疾病联系在一起，对于疾病的诊断、治疗和预后有着重要的意义。在蛋白质检测中，实现微量、动态、实时且快速，是目前广大科研工作人员的关注点。纳米技术在生物领域形成了纳米生物技术，将纳米材料应用于生物传感器可以很大程度的提高传感器的性能。脂质体作为新型纳米诊断颗粒，既可以链接不同的配体如抗原、抗体、生物素、羧基等，又可以包封不同的标记物，检测模式多种多样。可以作为信号转导、信号转化、信号放大的良好载体，具有广泛的应用前景，在高灵敏度和多种检测方法联合应用上有其优越性。本论文以临床常用肝癌、胰腺癌及炎症生物标记物为蛋白检测模型，与环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、手持荧光检测仪及微流控芯片等技术相结合，构建了一系列基于免疫脂质体纳米颗粒的生物传感器，并应用与临床标本，大大提高了检测灵敏度及即时检测(Point-of-care testing，POCT)技术。　　第一部分 基于生物荧光脂质体和便携式ATP荧光检测仪在肝癌诊断中的应用　　本部分，我们研发了一种超灵敏的基于磁性-生物荧光脂质体的生物传感器，使用便携式三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)荧光检测仪用于血液中蛋白质生物标志物的POCT检测。在这项研究中，我们使用甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP，肝癌相关的蛋白质生物标志物)作为模型蛋白。羧基磁珠偶联单克隆抗体捕获样本中的靶蛋白，随后与标记有生物荧光脂质体的多克隆抗体结合，形成磁珠-靶蛋白-脂质体复合物。脂质体破膜后，包裹在内腔的ATP释放，可用便携式荧光仪进行读数。在此过程中，我们使用便携式磁珠分离笔来简化步骤。相对光单位(Relative light units,RLUs)与AFP浓度在0.05和1000ng/mL之间呈线性相关，最低检测限(Limit of detection，LOD)为0.01ng/mL。当RLUs大于300，即AFP浓度大于25ng/mL时即有诊断意义。我们称这种基于生物荧光脂质体和便携式ATP荧光的检测技术为LBM(The bioluminescent nanoliposomes conjugated to magnetic particles)。此方法对AFP显示出高度特异性，在25ng/mL浓度下与其他蛋白质无反应。通过LBM方法对40个临床样品(20例AFP阳性和20例AFP阴性)进行实际应用测试，结果与罗氏电化学发光测定的结果一致，相对偏差小于10％。这种LBM技术在血液中的成功应用为其他生物标志物检测提供了的新的思路，也显示出了其在临床诊断的POCT中的巨大潜力。　　第二部分 基于生物素化脂质体和LAMP的生物传感器在胰腺癌诊断中的应用　　随着蛋白质组学的发展和痕量蛋白质生物标志物的不断发现，准确定量低丰度蛋白，特别是尿液中的蛋白质对临床诊断具有重要意义。在这部分，我们研发了一种新的基于纳米生物素脂质体结合LAMP的超灵敏检测蛋白标记物技术。选择REG1A（一种可用于胰腺导管腺癌诊断的尿生物标志物）为蛋白模型。我们称这种检测方法为LI-LAMP(Nano-biotinylated liposome-based loop-mediated isothermal amplification)。此方法将DNA作为报告分子，包封于三代脂质体内，并在表面标记生物素化配体，结合核酸扩增产生三倍信号放大。此方法用于REG1A诊断特异性高，线性检测范围为1fg/mL至1μg/mL，LOD为1fg/mL，蛋白回收率为89％-130％。实际样品应用于经典ELISA试剂盒方法结果一致，相对偏差不超过10％。LI-LAMP使用生物素化脂质体，可将保存期延长，通过生物素-亲和素桥联系统进一步信号放大，并可以很好地与现有的商业试剂盒对接，其超高的灵敏度为其他低丰度的蛋白标志物提供了可行的检测方法。　　第三部分 微流控芯片和量子点脂质体用于炎症标志物定量的iPOCT检测　　本部分，我们采用脂质体与量子点相结合，将油性量子点变为水溶性的纳米量子点脂质体微球，对蛋白标志物进行特异性的标记及识别，在微流控芯片上iPOCT实现快速、灵敏的诊断。我们命名此种方法为LQC(Liposome encapsulated quantum dots combined with microfluidic chip for iPOCT)。在这项研究中，我们使用降钙素原（Procalcitonin，PCT，炎症蛋白质生物标志物）作为模型蛋白。将多克隆抗体和羊抗鼠抗体按照一定的浓度和体积铺设于微流控芯片以形成检测线和控制线，结合区预先铺设与单克隆抗体偶联的量子点脂质体，将待测样本加样到结合区后，在毛细力的驱动下，进入反应区。结合自行研制的便携紫外激发设备和手机应用程序进行读数分析，并对可行性进行验证。RGB传感器检测可知，G通道和PCT浓度在0-10ng/mL之间呈线性，LOD为0.5ng/mL。此方法对PCT显示出高度特异性，在2ng/mL浓度下与其他蛋白质无反应。通过LQC方法对20个临床样品（10例PCT阳性和10例PCT阴性）进行实际应用测试，结果与罗氏电化学发光测定的结果一致。本方法大大简化了实验流程和步骤，只需要15min即可得到结果，非常适用于门诊、野外、床旁、家庭等自行检测。

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摘要

缩略词表

前言

第一部分 基于生物荧光脂质体和便携式ATP荧光检测仪在肝癌诊断中的应用

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 基于生物素化脂质体和LAMP的生物传感器在胰腺癌诊断中的应用

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 微流控芯片和量子点脂质体用于炎症标志物的iPOCT检测

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

全文总结

参考文献

综述 生物传感器在肿瘤标志物检测中的研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢