中药解毒颗粒对晚期肝癌患者肠道菌群的影响

摘要

背景:　　长期以来，中医药一直是治疗肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要力量。在国内，中医药被广泛应用于肝癌预防和治疗的全过程，尤其在晚期肝癌中的应用更为常见。多年的中西医结合研究为临床提供了为数不少的成药、验方，其疗效也逐步得到认可。2011年中国卫生部颁布的《原发性肝癌诊疗规范》明确将中医药列入晚期肝癌的系统治疗，并指出中医药“可以改善癌症相关症状和生活质量，可能延长生存期，可以作为肝癌治疗的重要辅助手段”。　　中药解毒颗粒是我科开发的院内制剂，在我科的日常肝癌防治中应用广泛，经过十几年的临床验证，疗效确切。但其作用机制尚不明确。众所周知，中药复方成分复杂，需要煎煮后，经患者口服，并通过肠道吸收代谢后发挥疗效，这就使其有效成分、及后续作用机制的研究变得相当复杂。近年来，肠道菌群与肿瘤相关联的研究备受关注，肠道也是中药吸收代谢的必经之地，因此，本课题想从肠道菌群的角度去探讨口服解毒颗粒所产生的影响。　　此外，免疫治疗是近年来治疗晚期肝癌的重要手段之一。其中，免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade)是当下研究的热门。细胞毒T淋巴细胞抗原-4(lymphocyte-associated antigen4，CTLA-4)及程序性细胞死亡受体1(programmed cell death protein1，PD-1)是常见的阻断靶点;阻断CTLA-4及PD-1，可以通过影响T细胞功能发挥抗肿瘤作用。有文献报道，肠道菌群可增强上述靶点的抑制剂的作用。因此，本课题以免疫检查点阻断为切入点，探讨解毒颗粒对CTLA-4及PD-1的调节作用。　　目的:　　1、观察解毒颗粒对晚期肝癌患者肠道菌群的影响。2、研究解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4与PD-1表达的调节作用。　　方法:　　1、选取年龄≥18岁、巴塞罗那临床肝癌分期为C期(BCLC-C)的HCC患者，随机分为解毒颗粒组和对照组，每组各10例。解毒颗粒组每日冲服解毒颗粒，早晚各一次;解毒颗粒组服药前留取一次粪便，服解毒颗粒后一个月与两个月各留取一次粪便，共三次。对照组不服用解毒颗粒，共留取三次粪便，每次间隔一个月。解毒颗粒组服药前留取一次静脉血，两个月后再留取一次静脉血，共两次。对照组共留取两次静脉血，间隔两个月。　　2、采用16S多样性测序分析对收集的粪便标本分别进行DNA提取、质量检测、测序，通过各菌属丰度产生的变化，观察解毒颗粒对肠道菌群所产生的影响，并通过SPSS21.0(IBM Corp)软件对数据进行统计学分析。两组细菌丰度治疗前后的变化趋势使用重复测量的多因素方差分析(ANOVA of repeated measurement data);菌属OTU水平的差异分析使用Kruskal-Wallis检验法(Kruskal-Wallistest)。　　3、采用流式细胞术探讨解毒颗粒对晚期肝癌患者外周血淋巴细胞CTLA-4及PD-1表达的影响。　　结果:　　1、解毒颗粒组的患者在服药前所具有的与肠癌、肝癌发病相关的梭菌属Ⅺ(ClostridiumⅪ)及消化链球菌科细菌（Peptostreptococcaceae）在服用解毒颗粒后一个月与两个月均消失不见，而在对照组中，上述两菌治疗前后无明显变化。2、对照组中，可以增强肝癌免疫抑制剂疗效的拟杆菌属细菌（Bacteroides）的占比随时间变化呈明显减少趋势，在各个时间点拟杆菌属细菌的占比差异具有统计学意义(P＜0.001)且时间与分组存在交互作用，时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.032)。而解毒颗粒组中拟杆菌属细菌的占比随时间变化并不明显。3、在解毒颗粒组中，可产生丁酸从而起到抗结肠癌作用的有益菌罗氏菌属细菌（Roseburia）随着时间变化，其占比呈增加趋势;而在对照组中，罗氏菌属细菌的占比随着时间变化呈减少趋势，且时间与分组存在交互作用，时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.029)。4、在解毒颗粒组中，与结直肠癌相关的普氏菌属细菌（Prevotella）的占比随时间变化呈减少趋势;而在对照组中，普氏菌属细菌的占比随时间变化呈增加趋势。虽然普氏菌属细菌的占比在两组中的变化趋势比较明显，两组在时间、时间与分组的因素上的差异并无统计学意义。5、在解毒颗粒组中，与结直肠疾病相关的毛螺旋菌科细菌（Lachnospiraceae）的占比随时间呈轻微减少趋势;而在对照组中，毛螺旋菌科细菌的占比随时间变化呈增加趋势，且时间与分组存在交互作用，时间因素的作用随分组的不同而不同(P=0.044)。6、随着时间的变化，解毒颗粒组的物种比起对照组更为相似。7、对照组中，晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度呈增长趋势;而在解毒颗粒组中，晚期肝癌患者外周血CD4+和CD8+的细胞中CTLA-4的阳性率及平均荧光强度较前变化不大或呈减少趋势。两组患者外周血CD4+和CD8+的细胞中PD-1的阳性率及平均荧光强度变化趋势均不明显。　　结论:　　通过观察中药解毒颗粒对BCLC-C肝癌患者肠道菌群的影响，发现解毒颗粒对有益菌拟杆菌属及罗氏菌属细菌有良性促进作用，对有害菌梭菌Ⅺ及消化链球菌科细菌可能有抑制作用，其中拟杆菌属与肝癌的免疫治疗疗效密切有关。还发现解毒颗粒对患者外周血CD4+和CD8+细胞中的免疫抑制蛋白CTLA-4的表达具有一定的抑制作用，该结论有待进一步的大样本实验进行验证。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 肿瘤患者对中医药类临床试验的态度、认知与实践

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分 解毒颗粒对晚期肝癌患者肠道菌群及外周血淋巴细胞免疫抑制蛋白的影响

一、实验材料、仪器和试剂

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

全文小结

参考文献

文献综述

附录

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢