纳米DBM作为支架表面修饰材料及骨移植替代物的实验研究

摘要

临床上多种骨科疾患需要骨移植替代物行植骨融合和骨结构修复重建，如创伤、肿瘤、骨折不愈合、骨组织发育不良、脊柱融合手术等等。骨结构修复重建是改善骨缺损患者日常生活质量、使其重新投入社会劳动的唯一有效方法，因此骨替代物的研究对社会发展具有极其重要的意义，也是骨组织工程的终极目标。　　目前已有数十种复合骨移植替代产品获美国FDA批准用于临床治疗，这些产品虽然具有良好的生物相容性，能一定程度上诱导成骨分化，但难以同时满足与宿主骨组织相匹配的机械性能和供成骨细胞渗透生长的合理三维孔隙结构，尤其在治疗大段骨缺损时，现有的骨移植替代物产品难以达到临床骨组织重建要求。鉴于天然骨组织特殊的生理微观结构，理想的骨替代产品应具备以下条件:(1)与宿主骨组织相匹配的机械强度;(2)恰当的孔隙率和孔隙结构;(3)利于细胞粘附、分化和增殖的表面结构;(4)良好的生物相容性以及与骨组织生长相适应的可控降解率。由此可见，当前的众多产品还远远达不到理想骨替代物的标准。如何改进骨替代原材料模拟构建骨组织结构技术，显得尤为重要。　　近年来，3D打印技术用于骨缺损的修复重建已成为一种新的热点及趋势，但单纯的3D打印支架成骨诱导和骨传导性能均欠佳，支架表面需要用一些具有骨诱导或成骨作用生物活性材料做修饰，才能改善其性能。目前用于表面修饰的材料主要是生物活性玻璃，生物陶瓷及纳米羟基磷灰石等，但上述材料成分均为无机物，且成骨诱导性能较差，表面修饰物中骨形态发生蛋白-2(BMP-2)虽然能改善支架成骨诱导功能，但其确实效果有待进一步实验考证。　　脱钙骨基质(DBM)主要由93％的胶原（传导成骨表面活性物质）、5％的可溶性蛋白（诱导成骨的骨形态发生蛋白和转化生长因子、胰岛素样生长因子等协同蛋白）以及2％的残余矿化基质，是具有良好的诱导成骨、传导成骨特性的商业化生物材料。它以单独或联合其他材料的方式广泛用于骨折、骨不连、骨肿瘤、骨融合、股骨头坏死等手术。但是DBM缺少骨矿物质，因机械强度较差而难以成为理想的骨移植替代物。但若将DBM经过一定的物理方法进行颗粒尺度上的改变，而后作为3D打印支架的表面修饰，这有可能使支架在获得稳定机械强度的同时，增加支架的骨诱导性和骨传导能力。　　将材料纳米化并应用于骨缺损的修复成为近年来骨组织工程的研究热点。其研究方向主要集中于矿化机理、改善支架骨诱导性能、组织修复、药物载体、细胞载体及基因载体等医学领域的应用，国内外学者在这一领域已取得了良好的进展。但众多骨移植材料中鲜有关于纳米同种（异体）脱钙骨基质(nDBM)的研究报道。纳米材料具有特殊的比表面积效应，它极易与外来原子吸附键结合，表现的特性不同于它在整体状态时的性质。研究表明，骨髓间充质干细胞及成骨细胞对纳米尺度材料极其敏感，在60-150nm时尤为明显，纳米颗粒及粗糙的纳米凹槽结构可有效增加丝状伪足的感知能力，促进细胞扩散及粘附，使其在纳米纤维构成的三维微环境快速增殖。　　为此，本课首先通过改良Urist法制备冻干脱钙骨基质，运用二次低温物理研磨法将DBM研磨至纳米级别，电镜检测其粒径尺度并对其生物安全性进行系统评价。随后将实验组前期制备的PCL-TCP3D打印支架进行nDBM表面修饰，并通过体外细胞实验及动物骨缺损模型填充等实验，对其生物相容性及体内骨缺损修复效果进行评估。通过以上努力，发展具有中国自主知识产权的高生物安全性骨修复用生物材料的制备新方法，并为该种新型骨组织工程支架的进一步的应用提供科学依据。　　第一部分:nDBM的制备及性能检测　　目的:旨在通过物理研磨法将块状DBM处理至纳米级，并对研磨效果及材料的生物安全性进行检测　　方法:采用低温研磨法，先将DBM初步研磨至微米级别颗粒，再通过高能球磨机进行纳米尺度研磨，扫描电镜观测研磨效果及材料形貌。而后按医用生物植入材料安全标准ISO10993(GB/T16886)对nDBM行急性毒性实验、溶血实验、致敏试验及细胞毒性试验，评价材料的生物安全性。　　结果:经二次低温物理研磨后，所制得的nDBM底层致密，呈纤维状相互连接，纤维粗细不等，直径约40-80nm，表面充满不规则纳米颗粒，颗粒直径20nm-50nm左右，纳米颗粒相互团聚，表面密布纳米级别凹槽，纳米纤维结构间相互连接，内部形成大量相互连通的微米级别孔隙，其微观结构符合纳米生物材料范畴。实验结果证明，nDBM不引起实验动物急性毒性反应，溶血率复合生物材料安全性要求，无致敏现象发生，细胞毒性实验显示细胞增殖良好。因此，nDBM具有良好的生物相容性，可用于体内植入实验。　　结论:低温物理研磨法能成功将DBM纳米化，材料的生物安全性指标符合医用植入材料安全标准。　　第二部分:nDBM/PCL-TCP复合支架的构建及生物学性能检测　　目的:将nDBM修饰于PCL-TCP3D打印支架表面，并对各组材料的生物相容性及成骨诱导性进行检测。　　方法:采用浸泡冻干法将nDBM均匀负载于支架表面，通过扫描电镜观察复合支架构建效果，而后进行体外细胞学实验，CCK-8法检验骨髓间充质干细胞的增殖情况，实时荧光PCR、Westen bolt检测材料成骨诱导相关基因及蛋白的表达，并对统计结果进行分析。　　结果:采用75％的乙醇作为溶剂，按nDBM与稀释剂1∶5的比例浸泡后的支架，经冻干后，可使支架各纤维表面均匀覆盖nDBM颗粒，电镜扫描观察发现，nDBM与支架粘附良好，底层致密，表面布满大小不一的nDBM颗粒，纳米颗粒部分团聚，表面布满纳米级别凹槽，成功构建了一种新型的nDBM/PCL-TCP复合支架。通过CCK-8检测BMSCs的增殖情况，通过绘制细胞生长曲线，发现细胞在nDBM修饰的支架表面不断增殖，各时间点细胞增长数量均高于单纯PCL-TPC支架。Western blot、real-time PCR等多种实验表明nDBM修饰的复合支架各成骨相关基因及蛋白表达水平明显高于单纯支架组。　　结论:采用冻干法能成功制备具有纳米级别表面结构的nDBM/PCL-TCP复合支架。CCK-8、Western blot、real-time PCR等多种实验表明nDBM修饰的复合支架有利于BMSCs增殖并向成骨细胞方向分化。　　第三部分:nDBM对兔股骨和nDBM/PCL-TCP复合支架对兔桡骨大段骨缺损修复的实验研究　　目的:评价nDBM对兔股骨缺损及nDBM/PCL-TCP复合支架对兔桡骨大段骨缺损的修复能力。　　方法:建立兔股骨缺损模型，将nDBM填充入缺损部位并设立空白对照组;建立兔桡骨大段骨缺损模型，将nDBM/PCL-TCP复合支架植入缺损部位，对照组植入单纯PCL-TCP支架。术后一定的时间点处死动物取材，通过大体观察，Micro CT及组织切片染色等评价材料骨缺损修复情况。　　结果:大体观察见nDBM填充组骨缺损区皮质已基本愈合;nDBM/PCL-TCP复合支架组骨缺损两端已有骨痂形成。影像学检查提示nDBM组骨修复效果优于空白组;nDBM/PCL-TCP复合支架组骨痂明显生成，部分支架纤维表面甚至已形成骨桥，优于单纯PCL-TCP支架。组织切片染色显示nDBM修饰的复合支架孔隙内大量骨细胞长入、纤维形成，部分支架表面甚至形成板层骨，骨诱导及成骨性能均优于单纯PCL-TCP支架组。　　结论:nDBM/PCL-TCP复合支架能有效促进大段骨缺损区域骨再生与骨重建，PCL-TCP支架经nDBM修饰后，骨诱导与骨传导性明显增强，有利于新生骨向支架内长入。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

实验一 nDBM的制备

一、材料与研磨方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

实验二 nDBM的生物安全性检测

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

附录

第二部分 nDBM／PCL-TCP复合支架的构建及生物学性能检测

二、结果

三、讨论

四、结论

实验二 nDBM／PCL-TCP复合支架成骨诱导性能检测

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

附录

第三部分 nDBM对兔股骨和nDBM／PCL-TCP复合支架对兔桡骨大段骨缺损修复的实验研究

实验一 nDBM填充促进兔股骨缺损修复的实验研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

实验二 nDBM／PCL-TCP复合支架治疗修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

附录

综述：纳米骨组织工程材料研究进展

在读期间发表的论文

致谢