腺苷A2A受体在肝细胞癌发生发展中的作用及机制研究

摘要

目的:　　肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，高居于癌症相关死亡率第三位1，2。全球超过一半的肝细胞癌死亡病例发生在中国1。目前肝细胞癌的治疗方法包括手术切除、肝移植、介入治疗、放化疗及靶向治疗。手术切除仍是治疗肝细胞癌的主要治疗方法，然而根治性切除后复发率高、转移率高仍是影响肝细胞癌患者术后预后的主要因素。因此，探索影响肝细胞癌生长、侵袭、转移的因素并针对此开发新的治疗措施，是当今肝细胞癌研究中的重点和难点。　　腺苷(Adenosine)是合成三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)的前体物质，同时，作为腺嘌呤核苷酸代谢的中间产物，腺苷几乎产生于所有的细胞，普遍存在于机体的各个系统。腺苷通过A1、A2A、A2B和A3四种腺苷受体作用于人体各个系统，参与多种生理病理过程的调节。越来越多的证据表明，腺苷对人体的多种疾病的发生过程都有十分重要的调节作用3。目前的研究发现，腺苷通过腺苷A2A受体参与了体内的多个病理生理过程的调节，在肿瘤微环境中亦起到了非常重要的调节作用。肿瘤微环境中的腺苷通过腺苷A2A受体抑制了免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。大量研究报道了选择性腺苷A2A受体拮抗剂可以重新激活肿瘤组织中的免疫细胞的免疫作用，因此，选择性腺苷A2A受体拮抗剂有望用于肿瘤的辅助治疗。肿瘤微环境中的腺苷通过腺苷A2A受体在胸腺瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、人头颈部鳞状细胞癌中促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用已有相关研究报道4-7。　　目前，国内外尚无有关腺苷A2A受体在肝细胞癌中的表达及作用的研究报道。本研究拟通过实验研究腺苷A2A受体在肝癌组织及肝癌细胞中的表达状况，对肝细胞癌的增殖、凋亡、血管生成、侵袭的影响，并结合临床，对腺苷A2A受体表达水平与患者预后的关系作出分析，并初步探索腺苷A2A受体的下游信号通路，通过研究，初步探索腺苷A2A受体在肝细胞癌的发生、进展过程中的作用。　　方法:　　一、肝癌组织和癌旁组织中腺苷A2A受体的表达水平　　1、肝癌组织及癌旁组织的收集:所有标本均采集自东方肝胆外科医院手术切除的肝癌及癌旁组织。（经东方肝胆外科医院伦理委员会批准，患者及家属知情并同意）　　2、肝癌及癌旁组织中腺苷A2A受体表达水平的检测:运用qRT-PCR、Western Blot免疫印迹检测每一组肝癌及癌旁组织中腺苷A2A受体表达水平。　　二、体外检测肝癌细胞株和正常肝细胞株中腺苷A2A受体表达的水平　　运用实时定量PCR技术检测腺苷A2A受体在人肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L02中的mRNA的表达水平。　　三、构建腺苷A2A受体的干扰慢病毒载体并包装慢病毒　　通过在线软件设计腺苷A2A受体的基因序列，体外合成后经酶切连接到pds019-p16.3-SHRNA-BSD质粒载体上，获得质粒CL810_PDS19-shADORA2A，经验证，酶切验证测序结果正确。用构建好的腺苷A2A干扰慢病毒载体CL810_PDS19-ADORA2A和包装质粒共转染293T细胞，包装慢病毒，收集病毒液并测定滴度。获得滴度合格的腺苷A2A受体干扰慢病毒LV478_PDS19-ADORA2A。　　四、建立腺苷A2A受体稳定低表达肝癌细胞株　　用包装好的腺苷A2A受体干扰慢病毒感染HepG2靶细胞，感染72小时后观察到荧光比例分布达到90％以上，同时未观察到大面积细胞死亡的现象，用qRT-PCR技术检测腺苷A2A受体在两组中的表达水平，结果表明，实验组的腺苷A2A受体mRNA水平较对照组明显降低，沉默效率＞70％。说明所构建的慢病毒对腺苷A2A受体表达的干扰效果好，可以用于研究腺苷A2A受体的功能及机制的实验。　　五、体外检测腺苷A2A受体对肝癌细胞株生物学行为的影响　　为了检测腺苷A2A受体对肝癌细胞株生物学行为的影响将通过质粒转染沉默表达腺苷A2A受体的肝癌细胞设置为实验组(shA2A组)，将转染无序序列质粒的肝癌细胞设置为阴性对照组(NC组)，将没有转染任何序列和质粒的肝癌细胞设置为空白对照组(KB组)。我们的预实验结果显示，腺苷在100μM浓度时，对肝癌细胞的促增殖、促侵袭、抗凋亡等作用最强，因此为研究腺苷对肝癌细胞生物学行为的影响，同时将三组细胞加入到100μM浓度的腺苷中，观察在100μM的腺苷环境中，肝癌细胞各种生物学行为的变化。因此同时设置了shA2A+adenosine组、NC+adenosine组和KB+adenosine组。一共有6组细胞进行体外细胞实验。　　1、腺苷A2A受体沉默对肝癌细胞株增殖的影响:CCK-8法检测六组细胞在培养24小时、48小时、72小时和96小时480nm处的相对吸光度值(OD值)，并绘制相对吸光度曲线。　　2、腺苷A2A受体沉默对细胞凋亡的影响:将六组细胞AnnexinⅤ和7-AAD细胞染色后，用流式细胞仪检测其凋亡发生的比例。　　3、腺苷A2A受体沉默后对VEGF表达的影响:qRT-PCR检测六组细胞VEGFmRNA的表达量。　　4、腺苷A2A受体沉默对血管生成能力的影响:取等量六组细胞分别与HUVECs细胞共培养24小时后，在倒置200倍显微镜下观察HUVECs在基质胶上的管样结构生成数量，并随机取三个视野计算血管生成长度。　　5、腺苷A2A受体沉默后对肝癌细胞侵袭能力的影响:将等量的六组的细胞分别接种于有胶质的transwell小室，24小时后结晶紫染色，随机选取3个高倍镜(×400)视野，计数下室的细胞数即为穿透胶的细胞数。　　六、腺苷A2A受体高表达与肝癌患者预后的关系　　采用SPSS23.0软件进行数据分析。应用Kaplan-Meier法绘制总生存期(overall survival，OS)和无瘤生存期（disease free survival，DFS）曲线，应用Log-rank检验比较不同组生存曲线的差异。应用Cox比例风险回归模型行OS和DFS影响因素的单因素分析和多因素分析。采用X-tile软件确定腺苷A2A受体表达水平的最佳截断值为57.7，使2组患者进行术后生存期比较时P值最小(Pmin=0.0023)，检验水准（α）为0.05。　　七、腺苷A2A受体介导的下游信号转导通路初探　　运用Western Blot免疫印迹的检测方法，检测六组细胞中AKT、p-AKT、ERK和p-ERK蛋白表达水平在腺苷A2A受体沉默前后的变化。　　结果:　　1、qRT-PCR的结果表明，腺苷A2A受体在肝癌组织中的相对表达量为2.015±0.078，在癌旁组织中的相对表达量为1.329±0.071，肝癌组织中腺苷A2A受体的表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.001)。Western-blot结果也显示，与癌旁组织相比，肝癌组织内的腺苷A2A受体的表达水平升高。　　2、qRT-PCR的结果表明，HepG2细胞株的腺苷A2A受体的表达量明显高于L02细胞系，差异有统计学意义。　　3、CCK-8细胞增殖实验检测腺苷A2A受体表达沉默后，腺苷对肝癌细胞株的促增殖作用基本消失。　　4、流式细胞仪的结果显示，腺苷A2A受体沉默抑制了腺苷的抗凋亡作用。　　5、qRT-PCR的结果表明，腺苷A2A受体沉默减弱了腺苷促进VEGF表达的作用。　　6、HUVECs血管生成实验的结果表明，腺苷A2A受体沉默后腺苷促血管生成作用减弱。　　7、Transwell细胞侵袭实验表明，腺苷A2A受体沉默后腺苷促肝细胞癌侵袭能力减弱。　　8、腺苷A2A受体高表达患者的术后1年、3年OS率低于腺苷A2A受体低表达患者。多因素分析的结果表明，腺苷A2A高表达为影响肝癌患者OS的独立危险因素。　　9、Western Blot的初步结果表明，腺苷能够促进p-AKT和p-ERK蛋白的表达，腺苷A2A受体沉默抑制p-AKT和p-ERK蛋白表达。　　结论:　　我们的研究发现，腺苷A2A受体在肝癌组织和肝癌细胞中高表达。腺苷具有促进肝癌细胞增殖、抑制肝癌细胞凋亡、促进血管生成、促进肝癌细胞的侵袭的作用。腺苷A2A受体沉默后，腺苷对肝癌细胞生长的正向调节作用明显减弱。腺苷A2A受体高表达是影响肝细胞癌患者OS的独立危险因素。对腺苷A2A受体的下游信号通路的初步研究表明，腺苷A2A受体可能介导了PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK两条信号通路。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 腺苷A2A受体在肝细胞癌中的表达

一、材料方法

二、结果

三、讨论

四、小结

第二部分 腺苷A2A受体沉默对肝癌细胞株生物学行为的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

第三部分 腺苷A2A受体表达水平与肝癌患者预后的关系

一、材料方法

二、结果

三、讨论

四、小结

第四部分 腺苷A2A受体介导的下游信号通路初探

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

综述

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢