PDLIM5调控前列腺癌细胞增殖转移的机制研究

摘要

目的：　　通过研究PDLIM5在前列腺癌组织及细胞系中的表达水平，验证PDLIM5在前列腺癌中的异常高表达。筛选高表达PDLIM5细胞株进一步进行生物功能学实验，以探索PDLIM5介导肿瘤发生及转移的生物学功能及调控机制。　　方法：　　（一）PDLIM5在前列腺癌相关芯片数据库中表达分析及组织标本验证　　收集Oncomine、PROGGENE数据库中的前列腺癌样本中PDLIM5表达、转移及预后相关信息，验证PDLIM5在癌和正常腺体中的表达差异，明确高表达PDLIM5与PCa转移预后的相关性。进一步收集长征医院泌尿外科前列腺癌根治术后临床组织样本44例，运用免疫组织化学染色法检测癌和癌旁组织标本明确PDLIM5组织表达水平。　　（二）前列腺癌PDLIM5敲减细胞株筛选及构建与沉默效率验证　　在PCa常见细胞系中通过Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表达情况，选取高表达PDLIM5的转移性PCa细胞株DU145和PC-3作为后续实验对象，构建包含靶向干扰PDLIM5的质粒的慢病毒进行细胞感染。观察质粒上的报告基因荧光强度，并分别在mRNA及蛋白水平验证PDLIM5的敲减效率，确认沉默PDLIM5的细胞株构建成功。　　（三）检测PDLIM5沉默后前列腺癌细胞株增殖、细胞周期凋亡水平变化及对侵袭转移能力影响　　在稳定沉默PDLIM5的DU145和PC-3细胞中，通过MTT比色法、克隆形成试验来评估肿瘤细胞增殖能力的变化;通过细胞流式术检测细胞周期及凋亡水平变化以明确PDLIM5敲减后对肿瘤细胞的周期阻滞及诱导凋亡作用;通过划痕愈合实验及TRANSWELL实验来检测PDLIM5对肿瘤迁移侵袭的影响。　　（四）PDLIM5对前列腺癌增殖转移调控机制的初步探究　　根据细胞表型相关实验结果及数据库信息分析，PDLIM5对肿瘤细胞的转移侵袭能力具有显著影响。首先在PDLIM5沉默状态下通过Western Blot和qPCR对上皮细胞-间充质转化(EMT)相关分子进行了检测，随后通过构建过表达质粒，在同种细胞株中过表达PDLIM5，检测EMT相关分子表达回复情况，并分别在PDLIM5敲减及过表达两种情况下对前列腺骨转移相关分析因子进行检测。最后通过免疫共沉淀，确定PDLIM5与AMPK的相互作用并对敲减PDLIM5后AMPK磷酸化水平进行检测，探索PDLIM5-AMPK-EMT的调控机制。　　（五）动物实验研究PDLIM5在体内功能作用　　使用沉默PDLIM5的DU145细胞进行裸鼠皮下成瘤实验，观察体内环境下PDLIM5敲减后对细胞成瘤及增殖能力的影响。随后将取瘤体组织进行裂解，通过Western Blot对PDLIM5蛋白表达水平进行检测，明确PDLIM5的沉默效率并检测AMPK、EMT相关信号通路分子表达变化，明确在动物实验中PDLIM5对细胞增殖转移的调控机制。　　结果：　　1.发现PDLIM5在PCa组织中异常高表达，并且与PCa生化复发与生存期相关。通过免疫组化及生物信息学分析方法，确认PDLIM5在PCa中较正常前列腺组织表达水平升高，且深入分析数据库芯片资料发现异常高表达的PDLIM5与预后不良因素如:转移、高Gleason评分及TMN分期相关。同时，通过多因素分析及生存分析发现高表达PDLIM5是PCa生化复发的独立危险因素并导致患者总生存率下降。　　2.成功建立稳定沉默PDLIM5的DU145及PC-3细胞株，通过相关细胞学实验发现沉默PDLIM5可导致前列癌细胞恶性增殖、克隆形成、侵袭转移能力受抑制，并可诱导G2/M阻滞和细胞凋亡的发生。　　3.检测PDLIM5敲减后上皮-间质转化(EMT)相关分子表达水平，通过Western Blot及qPCR发现人紧密连接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出现不同程度下调，而EMT关键分子E-cadherin表达量上升，证实EMT过程受到抑制。　　4.在DU145及PC-3细胞中过表达PDLIM5可以在一定程度上通过上调SNAIL的表达，从而使及关键分子E-cadherin表达量下降，证实PDLIM5对细胞侵袭和转移的影响与EMT密切相关。同时在细胞实验中检测已知促进前列腺癌骨转移的相关分子，如结缔组织生长因子(CTGF)，甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。qPCR结果显示，沉默PDLIM5后，PC-3细胞中这些促肿瘤转移因子的表达显着下调。当PDLIM5过表达时，这些分子的表达水平出现上调，且在DU145细胞中也观察到类似的结果，进一步证实PDLIM5在促进肿瘤转移中起作用　　5.免疫共沉淀确定PDLIM5可与AMPK相结合，敲减PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。随后通过放线菌素阻断上游蛋白质合成，在给药后不同时间点检测AMPK蛋白水平，结果发现PDLIM5沉默组AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通过维持AMPK的稳定性，使AMPK通路持续性激活，从而促进前列腺癌的恶性增殖及转移。　　6.裸鼠成瘤实验证明在体内条件下，沉默PDLIM5可抑制肿瘤细胞生长。通过组织蛋白水平检测，在动物实验中PDLIM5同样可通过AMPK-EMT相关通路对前列腺癌细胞增殖及转移进行调控。　　结论：　　本研究证实了PDLIM5表达水平在PCa组织中发生上调，表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通过生物信息学分析探索PDLIM5与PCa复发和转移的关系，表明高表达PDLIM5是前列腺癌预后不良的相关因素。此外，细胞和动物实验都表明，PDLIM5通过激活AMPK通路可以促进癌细胞的增殖并增强EMT介导的侵袭和转移。探索PDLIM5相关相关通路及作用靶点可能有助于丰富PCa的进展和转移机制，并为mCRPC患者带来新的治疗策略。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分：PDLIM5在前列腺癌相关芯片数据库中表达分析及组织标本验证

一、数据收集及实验方法与实验材料

(一) Oncomine数据库资料筛选与摘录方法

(二)PROGgene数据库数据摘录

(三) 前列腺癌组织标本收集与临床病理信息采集方法

(四) 免疫组化实验材料及染色方法

(五)数据统计及作图方法

二、实验结果

(一) 数据库中PDLIM5在前列腺癌及正常腺体组织中差异表达情况

(二) 免疫组化方法在组织标本中验证PDLIM5在前列腺癌及正常腺体组织中差异表达

(三)数据库资料提示PDLIM5异常高表达与前列腺癌不良预后相关

(四) PDLIM5为前列腺癌生化复发的独立危险因素

第二部分：前列腺癌PDLIM5敲减细胞株筛选及构建与沉默效率验证

一、材料与方法

(一) 实验主要材料

(二) 细胞培养方法

(三) 敲减PDLIM5前列腺癌细胞株的选择与构建

(四) 在前列腺癌细胞株中敲减PDLIM5效率检测

(五) 统计学方法

二、实验结果

(一)各前列腺细胞株中PDLIM5蛋白及mRNA表达水平

(二)慢病毒转染效率检测及荧光拍照

(三)前列腺癌细胞株中成功敲减PDLIM5表达

第三部分：检测PDLIM5沉默后前列腺癌细胞株增殖、细胞周期凋亡水平变化及对侵袭转移能力影响

一、实验方法及材料

(一)细胞增殖实验(MTT法)

(二)克隆形成实验

(三) 流式细胞术检测细胞周期及凋亡

(四)细胞划痕实验

(五)Transwell测定前列腺癌细胞迁移侵袭能力

二、实验结果

(二) 沉默PDLIM5在DUl45和PC-3细胞中诱导G2／M阻滞和细胞凋亡

(三) 敲减PDLIM5导致前列腺癌细胞株的迁移侵袭能力下降

第四部分：PDLIM5对前列腺癌增殖转移调控机制的初步探究

(二)RT-qPCR实验

(三) 构建过表达PDLIM5的前列腺细胞株

(四)免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)

二、实验结果

(一)沉默PDLIM5后逆转上皮间质化转化(EMT)表型

(二)前列腺癌细胞株中过表达PDLIM5慢病毒感染及效率检测

(三)过表达PDLIM5后促EMT及骨转移相关分子表达量上升

(四)PDLIM5可以直接与AMPK蛋白相互作用以维持其活化并减少AMPK降解

第五部分：动物实验研究PDLIM5在体内功能作用

一、材料与方法材料

(一) 裸鼠成瘤实验

(二) 成瘤瘤体组织蛋白检测

二、实验结果

(一) 裸鼠成瘤实验模型结果提示沉默PDLIM5后Dul45细胞在体内成瘤能力受抑制

(二)体内实验提示敲减PDLIM5后通过影响体内AMPK及EMT通路抑制肿瘤细胞增殖转移

讨论

结论

后续研究计划

参考文献

综述

研究生期间发表论文及科研情况

致谢