老年中国恒河猴免疫衰老特征和SIV感染早期的致病机制研究

摘要

近几年来老年艾滋病(AIDS)患者正在逐年增加，老年人也已经成为人免疫缺陷病毒(HIV)感染高危人群，老年艾滋病正逐渐得到广泛关注。然而目前中老年HIV感染者的治疗效果并不理想，即使在有效的抗病毒治疗情况下老年艾滋病人的死亡风险和AIDS进展风险仍要高于年轻感染者，免疫重建效果也远不如年轻患者。免疫衰老(Immunosenescence)可能是造成这种现象的主要因素。一方面HIV感染诱发的一些免疫学改变十分类似于老年人的免疫系统特征，如T细胞更新能力降低、B细胞减少、终端分化的记忆性细胞亚群逐渐累积、T细胞和B细胞库多样性降低和免疫反应能力减弱等，其与快速的HIV疾病进展、多种非AIDS并发症发生和抗病毒治疗效果密切相关。另一方面正常发生的免疫衰老是老年人死亡和发病的强烈预示因子，致使老年人免疫反应能力低下和易感性增加。因此在HIV感染诱导的和自然发展的免疫衰老双重影响下，也就不难理解为何老年艾滋病人的疾病进展更快以及临床疗效不容乐观。
　　然而免疫衰老和老年艾滋病之间的关系仍不清楚，也缺乏针对性的治疗方案。主要研究瓶颈在予难以在HIV整个感染过程中纵向研究老年艾滋病发病机制，而解决问题的关键在于合适的动物模型。在过去的50多年中，以印度恒河猴（Indian rhesus macaque，InRM）、食蟹猴(Cynomolgus monkey)和平顶猴(Pig-tailed macaque)为代表的亚洲猕猴作为实验动物为超过70种人类感染性疾病的发病机理研究和疫苗与药物开发起到重要作用，尤其是在艾滋病研究领域无法替代。此外猕猴是一种长寿的灵长类动物，其遗传学和生理学背景比啮齿类动物更为接近人类，在免疫衰老的研究中具有直接优势。目前研究也已经表明恒河猴是一种研究免疫系统衰老特征和机制的理想模型动物。
　　近几年中国恒河猴(Chinese rhesus macaque，ChRM)广泛用于人类疾病模型研究，用以取代资源枯竭的印度恒河猴。猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的中国恒河猴ADS模型能够很好地模拟治疗和未治疗的HIV感染，疾病进程较印度恒河猴和平顶猴慢，抗病毒治疗效果更类似于HIV感染者，更适合于艾滋病模型研究和应用。此外许多证据表明老年猕猴易感多种传染病，SIV天然宿主的AIDS病例绝大多数也是老年动物，提示中国恒河猴在免疫衰老与HIV/SIV感染相互作用的研究中可能具有重要开发价值。目前既缺乏中国恒河猴免疫衰老特征的基础数据，国内外也无老年艾滋病猕猴模型的报道。本博士论文研究中国恒河猴的免疫衰老特征，建立老年中国恒河猴AIDS动物模型研究老年AIDS疾病机制，最终为老年AIDS的临床治疗提供支持。
　　首先我们设计了横向研究实验来检测年龄范围从2至24岁的中国恒河猴外周血T细胞与B细胞的年龄相关表型变化。在这项研究中，中国恒河猴展现了与人类免疫衰老预期的相似性，如B细胞和初始T细胞减少、效应记忆性CD8+T细胞的扩增、初始淋巴细胞向记忆性表型转化以及性别差异等现象。此外，也发现了其它潜在的免疫衰老特征，如CD4+T细胞PD-1表达上调和B细胞CD95表达上调。中国恒河猴的免疫衰老速度显著快于印度恒河猴，要达到同样的免疫衰老程度印度恒河猴需要超过20岁。不同于印度恒河猴，中国恒河猴衰老过程中CD4/CD8比值进行性降低，老年雄性中国恒河猴呈现更为严重的免疫危险表型（严重的CD4/CD8比例倒置和CD4+初始T细胞减少），都更类似于人类免疫衰老，将会是研究免疫衰老的良好动物模型。
　　随后我们用SIVmac239病毒感染6只年轻雄性中国恒河猴和12只老年雄性中国恒河猴，持续观察3个月的早期感染，密集监测它们的病毒学、免疫学和宿主基因表达变化，研究老年AIDS的疾病特征和免疫衰老作用于老年AIDS的机制。在感染42天后陆续有4只老年猴因为AIDS并发症死亡，老年猴的血浆病毒载量快速上升，CD4+T细胞迅速减少，CD4/CD8比值在急性期严重倒置，表明其疾病进展更快和发展为AIDS的风险更高。感染前低水平的CD4+初始T细胞比例和感染后高水平的初始T细胞增殖能力预示了进一步的疾病进展，表明初始T细胞在SIV感染早期起到十分重要的免疫保护作用，正是因为老年猴缺乏初始淋巴细胞而无法有效控制疾病进展。老年猴的宿主反应更快更强，与其快速提高的稳态增殖水平和严重的CD4+初始T细胞耗竭相关。这种补偿效应虽然能一定程度上缓解老年猴的CD4+初始T细胞缺失，实际上却加重了宿主的免疫活化和炎症，从而加速疾病进展。以上研究结果表明，SIV感染的老年中国恒河猴是用于研究老年AIDS发病机制的良好动物模型，老年艾滋病的治疗手段应着重于逆转免疫衰老和控制异常的免疫反应。

目录

声明

摘要

缩略词

第1章 绪论 老年艾滋病免疫衰老作用机制的研究进展

1．1 引言

1．2 免疫衰老的研究进展

1．2．1 免疫衰老的含义

1．2．2 天然免疫系统的衰老特征

1．2．3 适应性免疫系统的衰老特征

1．2．4 免疫危险表型和炎性衰老

1．3 HIV感染诱发免疫衰老

1．4 免疫衰老影响HIV疾病进展和治疗效果

1．5 针对免疫衰老的AIDS治疗策略

1．6 结语

第2章 中国恒河猴外周血淋巴细胞衰老表型的研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验溶液

2．2．4 实验耗材

2．2．5 流式抗体

2．2．6 仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 中国恒河猴血液采取

2．3．2 PBMC的分离

2．3．3 绝对计数样本制备

2．3．4 表型检测样本制备

2．3．5 Ki67检测样本制备

2．3．6 流式检测前准备

2．3．7 细胞绝对计数检测与分析

2．3．8 T细胞亚群的检测与分析

2．3．9 CD4+T细胞亚群CD38分子表达分析

2．3．10 CD8+T细胞亚群CD38分子表达分析

2．3．11 CD4+T细胞亚群PD-1分子表达分析

2．3．12 CD8+T细胞亚群PD-1分子表达分析

2．3．13 B细胞亚群的检测与分析

2．3．14 B细胞亚群CD95分子表达分析

2．3．15 T细胞亚群和B细胞亚群的Ki67表达分析

2．3．16 统计分析

2．4 实验结果

2．4．1 老年中国恒河猴CD4+T细胞和初始T细胞数量减少

2．4．2 老年雄性动物的CD4+T细胞与初始T细胞数量减少更为严重

2．4．3 中国恒河猴T细胞亚群比例水平上的衰老变化更为显著

2．4．4 老年雄性中国恒河猴免疫危险表型最为严重

2．4．5 B细胞亚群免疫衰老变化

2．4．6 活化相荚分子在衰老过程中的变化

2．5 讨论

第3章 老年中国恒河猴SIV感染早期的致病机制的研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 实验动物和样本收集

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验溶液

3．2．4 实验耗材

3．2．5 流式抗体

3．2．6 引物序列

3．2．7 DNA定量PCR的标准品信息

3．2．8 仪器设备

3．3 实验方法

3．3．1 SIVmac239病毒的培养

3．3．2 SIVmac239病毒漓度测定

3．3．3 SIVmac239病毒感染中国恒河猴

3．3．4 血浆病毒RNA纯化

3．3．5 血浆病毒载量检测

3．3．6 PBMC样本的RNA纯化

3．3．7 PBMC样本的DNA纯化

3．3．8 RNA样本逆转录

3．3．9 cDNA样本的实时荧光定量PCR

3．3．10 TREC、KREC和TCRAC定量PCR的标准品制备

3．3．11 TREC、KREC和TCRAC实时荧光定量PCR

3．3．12 绝对计数样本制备

3．3．13 表型检测样本制备

3．3．14 Ki67检测样本制备

3．3．15 流式细胞术分析

3．3．16 统计分析

3．3．17 使用R语言建立相关性矩阵

3．3．18 使用R语言进行主成分分析

3．3．19 使用R语言进行聚类分析

3．3．20 使用R语言进行相关性网络分析

3．4 实验结果

3．4．1 老年中国恒河猴SIVmac239感染后的疾病进展更快

3．4．2 老年中国恒海猴CD4+T细胞在SIV感染瑶快速减少

3．4．3 老年中国恒河猴初始T细胞增殖水平在SIV感染后迅速上调

3．4．4 老年中国恒河猴初始淋巴细胞在SIV感染后大量耗竭

3．4．5 老年中国恒河猴严重的免疫衰老程度预示了其快速的疾病进展

3．4．6 老年和年轻中国恒河猴宿主基因表达差异显著

3．4．7 老年中国恒河猴SIV感染后的宿主反应更为强烈

3．4．8 免疫衰老是老年中国恒河猴快速进展的关键因素

3．5 讨论

参考文献

论文总结

论文创新点

致谢

作者简历

附录