金黄色葡萄球菌SpoVG调控苯唑西林抗性的分子机制

摘要

由甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcusaureus，MRSA)导致健康个体感染的案例日益增多，已经引起全世界的广泛关注。MRSA菌株对绝大部分β-内酰胺类抗生素都具有抗性，这是由于它额外获得一个青霉素结合蛋白(penicillin-binding protein,PBP)PBP2a，后者对β-内酰胺类抗生素的亲和力比PBP2低很多。除PBP2a的表达负责更高水平β-内酰胺类抗生素抗性之外，许多内源基因已被鉴定为对苯唑西林抗性充分表达所必需。这些基因中的大部分被称为fem（甲氧西林抗性必需因子，factor essential for methicillinresistance）或aux（附属，auxiliary）基因，它们在肽聚糖代谢/结构上发挥直接或间接作用。
　　研究指出spoVG基因参与金黄色葡萄球菌苯唑西林抗性，然而调控机制并不清楚。在本研究中，我们发现SpoVG在MRSA菌株N315中可促进细胞壁合成并抑制细胞壁降解，从而在苯唑西林抗性中发挥正调控功能。在菌株N315中敲除spoVG后导致细菌苯唑西林抗性和头孢唑肟抗性都发生显著性降低。而自溶通常与盘尼西林和β-内酰胺类抗生素杀伤机制有关。我们同时也发现spoVG敲除株具有更高的TritonⅩ-100诱导自溶速率。
　　许多涉及细胞壁合成或细胞壁降解的基因会影响细菌甲氧西林抗性或自溶。为了探究在spoVG敲除株中这些基因的表达水平是否发生改变，我们利用实时荧光定量PCR检测17个潜在靶基因的转录水平，包括8个涉及细胞壁合成或苯唑西林抗性的基因femA、mecA、blaZ、pbp1、pbp2、pbp3、pbp4和vraS)和9个细胞壁降解相关的基因（atl、lyt、lrgA、arlS、sle1、lytS、cidA、lytM和sarA）。结果表明spoVG敲除株中共有8个相关靶基因转录水平发生改变:femA、mecA和blaZ的转录水平下降;lytN（编码胞壁质水解酶）的mRNA水平显著性提高，而lrgA（编码抗穿孔素）、sle1（编码胞壁质水解酶）和调控基因（lytS和arlS）的转录水平显著性下降。凝胶阻滞迁移电泳实验表明SpoVG蛋白可以直接结舍到lytN、 femA和lytSR（二元信号系统）的潜在启动子区域上。另外，我们也发现lytN、femA和lytSR的潜在启动子区域上至少存在2个5'-TAATTT/A-3'序列。
　　我们的实验结果揭示了mecA基因完整存在情况下，SpoVG通过调控细胞壁代谢进而影响细菌苯唑西林抗性的分子机制。虽然mecR1-mecI调控mecA的分子机制已经被广泛研究，但是由附属因子导致抗生素抗性的精确机制仍需深入研究。我们的研究表明SpoVG是一种新的附属因子，同时进一步阐明了fem/aux基因的调控通路。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 金黄色葡萄球菌概述

1．1．1 引言

1．1．2 金黄色葡萄球菌细胞壁结构

1．1．3 金黄色葡萄球菌肽聚糖合成

1．1．4 细胞分裂和自溶

1．1．5 金黄色葡萄球菌毒力因子

1．2 甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌

1．2．1 金黄色葡萄球菌耐药菌株的出现

1．2．2 细菌获得耐药的途径

1．2．3 金黄色葡萄球菌耐药菌株细胞壁的改变

1．2．4 可移动遗传元件SCCmec与MRSA耐药机制

1．2．5 影响细菌甲氧西林抗性的附属因子

1．2．6 MRSA流行病学

1．2．7 治疗MRSA的新药

1．3 金黄色葡萄球菌调控网络

1．3．1 常见的通用调控因子

1．3．2 调控蛋白SpoVG

1．4 本课题研究目的和研究内容

第二章 实验材料及方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 实验所用质粒

2．1．3 实验所用引物

2．1．4 所用试剂及培养基

2．2 实验方法

2．2．1 分子生物学相关方法

2．2．2 表型实验方法

2．2．3 蛋白表达纯化及相关体外实验方法

2．2．4 统计学分析

第三章 实验结果与讨论

3．1 实验结果

3．1．1 获得spoVG敲除株

3．1．2 敲除株对苯唑西林的抗性降低

3．1．3 敲除株对头孢唑肟的抗性也降低

3．1．4 敲除株有更高的自溶速率

3．1．5 敲除株中细胞壁代谢相关基因的转录水平有变化

3．1．6 SpoVG蛋白可以结合lytN、femA和lytSR启动子区域

3．1．7 敲除株对万古霉素和替考拉宁的抗性无明显变化

3．1．8 敲除株细胞壁厚度无明显变化

3．2 讨论

3．2．1 抗生素抗性与转录水平变化的基因

3．2．2 青霉素结合蛋白与附属因子

3．2．3 SpoVG特异性识别序列

3．2．4 总结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果