Fe3O4纳米颗粒极化肿瘤相关巨噬细胞的机制及其用于肿瘤免疫治疗的研究

摘要

肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)是一个免疫抑制性的体系，主要是因为存在免疫抑制细胞，而肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)就是免疫抑制细胞中占比最多的类型。TAMs可由促进肿瘤生长的M2型，极化为抑制肿瘤生长的M1型，故TAMs可作为潜在的进行抗肿瘤治疗的有效靶点。近年来，关于TAMs极化的研究报道很多，包括有药物R837、瑞喹莫德等，还有纳米材料诸如Fe3O4纳米颗粒、Cu2-xSe纳米颗粒等。这其中，有很多关于Fe3O4纳米颗粒极化TAMs的报道，一方面是由于Fe3O4纳米颗粒的高安全性，另一方面则是由于Fe3O4纳米颗粒不仅可以极化TAMs，还能与细胞内的过氧化氢产生ROS从而起到杀伤作用。但关于Fe3O4纳米颗粒极化TAMs的机理却一直没有统一的定论，相继有文献报道是基于芬顿反应，但均未给出机理证明。也有文献提及是因为细胞内铁的蓄积。因此，急需探究Fe3O4纳米颗粒极化TAMs的相关机制，考察其是否主要依赖于芬顿反应诱导的ROS途径，在此基础之上，才能更好的将Fe3O4纳米颗粒与其他TAMs极化药物联合使用，以期取得显著性的极化以及免疫治疗效果。　　为了方便联合使用其他药物，本文使用PLGA对Fe3O4纳米颗粒进行包封，同时为了增加巨噬细胞对纳米颗粒的摄取进而增强极化效果，采用细胞膜涂覆。基于此，本文设计并制备了一种利用PLGA同时包封Fe3O4纳米颗粒与R837的表面涂覆M1巨噬细胞膜的PLGA-ION-R837@M(PIR@M)纳米颗粒。将Fe3O4纳米颗粒联合R837以实现协同极化从而增强肿瘤免疫治疗的效果。制备过程如下：首先通过共沉淀法合成了油酸改性的Fe3O4纳米颗粒，采用乳化-溶剂挥发法制备了负载该Fe3O4纳米颗粒和R837的PLGA纳米颗粒，通过共挤出法涂覆上细胞膜，得到PIR@M纳米颗粒。通过动态激光散射纳米粒度仪(DLS)，透射电镜(TEM)，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)以及紫外-可见光分光光度计(UV-vis)等分别对其形貌，细胞膜的涂覆以及药物包载情况进行了表征，证明细胞膜涂覆纳米颗粒的成功制备，所得纳米颗粒分散均匀且呈球形，在10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline， PBS)里均具较好的稳定性。　　在体外实验中，使用荧光显微镜(FM)等考察了PI@M纳米颗粒的生物相容性和靶向作用。引入Vc消除PI@M纳米颗粒刺激巨噬细胞产生的ROS，用流式细胞仪(FCM)表征极化程度，并用普鲁士蓝染色法考察了细胞内铁的摄取情况证明了Fe3O4纳米颗粒极化巨噬细胞可能主要不是依赖于ROS诱导。将Fe3O4纳米颗粒联合R837(PIR@M)，进一步说明ROS不是Fe3O4纳米颗粒极化巨噬细胞的主要诱因，而且PIR@M纳米颗粒具有更优的极化作用。在4T1与M2巨噬细胞共培养体系中，PIR@M纳米颗粒显示出最高的体外细胞毒性。　　建立BALB/c小鼠原位4T1乳腺癌模型，考察了纳米颗粒在体内极化TAMs以及抗肿瘤的作用，进一步利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)证明了Fe3O4纳米颗粒极化TAMs主要依赖于干扰素调节因子5(interferon regulatory factor 5, IRF5)通路。同时包封Fe3O4纳米颗粒和R837的细胞膜纳米颗粒组极化效果最佳，也具有最优的抑瘤率即72.5%。通过对小鼠体重、组织学和血常规分析，证明本文所制备的生物材料没有全身毒性。

目录

声明

第1 章 绪论

1.1 引言

1.2 仿生纳米颗粒

1.2.1 红细胞膜

1.2.2 肿瘤细胞膜

1.2.3 巨噬细胞膜

1.3 肿瘤微环境与免疫应答

1.4 肿瘤相关巨噬细胞

1.5 极化肿瘤相关巨噬细胞

1.5.1 TLR激动剂

1.5.2 Fe3O4纳米颗粒

1.5.3 ROS

1.5.4 小干扰RNA

1.5.5 抗体

1.5.6 细胞因子

1.5.7 其他

1.6 本课题的研究目的、研究内容及创新点

1.6.1 本课题的研究目的

1.6.2 本课题的研究内容

1.6.3 本课题的创新点

第2 章纳米颗粒的制备及表征

2.1 前言

2.2 实验试剂与仪器

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 PI@M纳米颗粒的制备

2.3.2 PIR@M纳米颗粒的制备

2.3.3 粒径和电位

2.3.4 形貌表征

2.3.5 载药量和包封率

2.3.6 热重分析

2.3.7 磁性能分析

2.3.8 稳定性考察

2.3.9 Bradford蛋白浓度测定

2.3.10 SDS-PAGE分析

2.3.11 体外药物释放

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 粒径和电位

2.4.2 形貌表征

2.4.3 载药量和包封率

2.4.4 稳定性考察

2.4.5 细胞膜成分涂覆的表征

2.4.6 体外药物释放

2.5 本章小结

第3 章极化机制的研究及体外抗肿瘤免疫评价

3.1 前言

3.2 实验材料、仪器及细胞

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验仪器

3.2.3 实验细胞

3.3 实验方法

3.3.1 腹腔巨噬细胞的提取及培养

3.3.2 生物相容性评价

3.3.3 细胞吞噬实验

3.3.4 细胞靶向实验

3.3.5 Fe3O4纳米颗粒极化巨噬细胞的机理考察

3.3.6 Fe3O4纳米颗粒联合R837的极化效果考察

3.3.7 Fe3O4纳米颗粒联合R837的肿瘤细胞毒性

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 生物相容性评价

3.4.2 细胞的摄取及靶向实验

3.4.3 Fe3O4纳米颗粒极化巨噬细胞的机理考察

3.4.4 Fe3O4纳米颗粒联合R837的极化效果考察

3.4.5 Fe3O4纳米颗粒联合R837的肿瘤细胞毒性

3.5 本章小结

第4 章 纳米颗粒的体内极化和抗肿瘤效果

4.1 前言

4.2 实验材料、仪器及动物

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验仪器

4.2.3 实验动物

4.3 实验方法

4.3.1 肿瘤模型建立

4.3.2 极化巨噬细胞的考察

4.3.3 小鼠肿瘤体积及体重变化

4.3.4 组织学分析

4.3.5 血常规分析

4.3.6 统计学分析

4.4 实验结果与讨论

4.4.1 体内巨噬细胞的极化效果分析

4.4.2 体内抗肿瘤效果

4.4.4 血常规分析

4.5 本章小结

结 论

致 谢

参考文献

攻读硕士期间发表论文情况