MERS--CoV和SARS--CoV刺突蛋白及其与受体相互作用的结构与功能研究

摘要

2012年在中东地区暴发的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratorysyndrome coronavirus，MERS-CoV)是继2002年暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）之后又一高致病性冠状病毒。截至2017年3月，MERS-CoV共造成1917人感染，684人死亡，病死率高达36％，波及27个国家。冠状病毒(Coronavirus)是带有囊膜的单股正链非节段RNA病毒。根据基因型和血清型特性，冠状病毒分为四个属:α、β、γ、δ。迄今为止，确定能够感染人的冠状病毒有六种，分别是hCoV-NL63、hCoV-229E、 hCoV-OC43、hCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV，其中前两种冠状病毒属于α属，后四种属于β属。MERS-CoV和SARS-CoV均会引起严重的肺部疾病，是威胁人类生命健康和财产安全的病原体。 刺突蛋白（spike glycoprotein,S蛋白）是冠状病毒重要的结构蛋白。它是位于病毒囊膜表面的同源三聚体蛋白，参与受体结合和膜融合过程，不仅是决定宿主特异性的关键因素，还是中和抗体重要的靶向分子。S蛋白胞外段在蛋白酶的作用下能够被切割成位于N端的S1区和靠近病毒囊膜的C端S2区。S1区负责结合受体，S2负责病毒与宿主细胞的膜融合过程。S1区域包含两个相对独立的结构域:N端结构域（N-terminal domain, NTD）和C端结构域(C-terminal domain,CTD)。MERS-CoV就可以利用CTD中的受体结合区(receptor binding domain,RBD)结合受体二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase4，DPP4），也称为CD26。 为了揭示冠状病毒的入侵过程和跨种传播机制，我们需要充分了解S蛋白的结构与功能以及S蛋白与受体的相互作用。利用冷冻电镜技术解析的鼠肝炎病毒S蛋白，作为第一个冠状病毒S蛋白结构，为冠状病毒研究领域提供了重要的指导意义。鉴于MERS-CoV和SARS-CoV的高致病性及其S蛋白结构未知的现状，我们首先将关注的重点放在这两种冠状病毒S蛋白的结构研究中。此外，虽然有多项研究表明MERS-CoV是动物源性病毒，但是它的传播途径以及跨种传播机制并不是十分清楚。因此，本研究从受体CD26的角度去探讨MERS-CoV可能的宿主并将从分子层面解释病毒的跨种传播机制。 首先，本研究利用单颗粒冷冻电镜技术解析了近原子分辨率的MERS-CoV和SARS-CoV处于融合前构象的S蛋白结构。两种病毒的S蛋白在整体结构上与已经报道的其他冠状病毒类似，但是其受体结合区存在明显差异。我们捕获到两种状态的RBD:一种是包埋状(buried)（横卧状，lying state），另一种是暴露状（exposed）（站立状，standing state）。已报道的冠状病毒（MHV、hCoV-HKU1和hCoV-NL63）的RBD均呈横卧状，目前只在MERS-CoV和SARS-CoV中观察到站立状RBD。结构分析显示，横卧状的RBD将受体结合位点包埋在S蛋白中，而站立状RBD的受体结合位点是暴露的，这种构象有利于受体的结合。一些冠状病毒，如牛冠状病毒(BCoV)和鼠肝炎病毒(MHV)利用NTD结合糖或者受体分子以达到对宿主细胞的粘附和入侵目的，而有些病毒则利用CTD结合受体。此前对MERS-NTD和SARS-NTD的结构和功能并不清楚。因此我们利用X射线晶体学方法解析了MERS-NTD和SARS-NTD的结构。结果显示这两种NTD的糖结合区具有短螺旋结构和糖分子，因而无法通过结合糖来完成病毒对细胞的粘附。此外，通过对感染人的六种冠状病毒S蛋白的保守性分析发现，S2中的融合肽、七肽重复区1以及中心螺旋相对保守且易于接近，是寻找广谱性中和抗体和抑制剂的理想靶点。 其次，虽然蝙蝠被认为是冠状病毒的天然宿主，但是MERS-CoV在蝙蝠中的感染情况以及入侵机制还知之甚少。为了研究MERS-CoV对不同蝙蝠的感染能力，我们表达了七种蝙蝠的CD26，进一步的表面等离子共振技术(SPR)分析发现它们与MERS-RBD的结合能力不同:其中，亲和力最高的为大卫鼠耳蝠（Myotis davidii）CD26，而伏翼蝠（Pipistrellus pipistrellus）CD26几乎不结合MERS-RBD。流式细胞荧光分选术(FACS)和假病毒实验证实MERS-CoV能够通过结合蝙蝠CD26感染细胞。此外，本研究解析了大卫鼠耳蝠CD26与MERS-RBD的复合物晶体结构，从分子层面上解释了两者相互作用的结构基础。整体上蝙蝠CD26和MERS-RBD的结合与人CD26和MERS-RBD的作用方式类似。蝙蝠CD26的295位和336位氨基酸在与MERS-RBD相互作用中起到重要作用。实验结果显示，MERS-CoV对多种蝙蝠具有潜在感染能力，所以在MERS-CoV的防治中需要加强对不同种类蝙蝠的监控力度。 此外，本研究还通过对不同物种CD26与MERS-RBD的结合情况分析，初步探讨了MERS-CoV对不同物种的感染能力，为寻找潜在的中间宿主打下基础。MERS-RBD能够结合多个物种的CD26分子，如猴子、单峰驼、猪等，但不能结合猫、狗和鼠的CD26。虽然猪CD26与MERS-RBD的结合能力比人CD26低，但是MERS-CoV假病毒可以利用猪CD26作为受体感染细胞。为了进一步研究猪CD26与MERS-RBD之间的相互作用，我们利用晶体学方法解析了两者的复合物结构。晶体结构显示，与人CD26和MERS-RBD相比，猪CD26和MERS-RBD之间相互作用面积小且作用力弱，这可能就是猪CD26与MERS-RBD的亲和力比人CD26低的原因。有趣的是，猪CD26中339位的丝氨酸虽然不直接参与受体的结合，但是却能在很大程度上影响猪CD26与MERS-RBD的亲和力。S339C突变在C339和C328之间形成一个二硫键，而仅仅是该位点的单一突变就能将猪CD26与MERS-RBD之间的亲和力提高1000倍。这些结果说明MERS-CoV可能能够感染猪，为了验证这个结论，我们还在实验条件下用MERS-CoV感染丹麦长白猪(Danish Landrace piglet)。动物感染实验显示，尽管受试个体无明显的临床症状，但在其体内能检测到病毒复制以及抗体的存在。 综上所述，本研究通过冷冻电镜技术解析了MERS-CoV和SARS-CoV S蛋白的结构。S蛋白中不同状态RBD的存在说明病毒在与受体结合之前RBD需要进行构象变化从而暴露出受体结合位点，S蛋白的结构加深了我们对病毒入侵机制的理解。此外，利用X射线晶体学方法对MERS-RBD与蝙蝠CD26、MERS-RBD与猪CD26复合物结构的解析，结合生化、细胞实验说明MERS-CoV能够与多个物种的CD26分子结合，虽然结合力有所不同，但是也预示了MERS-CoV对不同物种存在潜在的感染能力。动物实验证明MERS-CoV能够感染猪，在MERS-CoV的传播过程中猪可能起到重要作用。这些结果有利于深入理解MERS-CoV的入侵过程和跨种传播机制，对冠状病毒感染的预防与治疗起到重要的指导意义。

目录

声明

摘要

第1章冠状病毒文献综述

1．1冠状病毒概述

1．1．1冠状病毒概述

1．1．2冠状病毒基因组和转录复制

1．1．3冠状病毒结构蛋白与功能

1．1．4冠状病毒复制周期

1．2冠状病毒与受体相互作用概述

1．2．1 SARS-CoV and ACE2

1．2．2 hCoV-NL63 and ACE2

1．2．3 MERS-CoV and CD26(DPP4)

1．2．4蝙蝠冠状病毒HKU4 and CD26

1．2．5 PRCV and APN

1．2．6MHV and CEACAM1

1．2．7其他冠状病毒受体研究进展

1．3冠状病毒跨种间传播研究进展

1．3．1 hCo V-C43跨种传播研究进展

1．3．2 SARS-CoV跨种传播研究进展

1．3．3MERS-CoV跨种传播研究进展

1．4冠状病毒疫苗研究现状

1．5疾病的治疗与预防

第2章MERS-CoV和SARS-CoV刺突蛋白的结构与功能研究

2．1前言

2．2实验材料与方法

2．2．1实验材料

2．2．2实验方法

2．3实验结果

2．3．2 MERS-CoV S-R751 S和SARS-CoV S的表达和纯化

2．3．3样品的制备以及结构对比分析

2．3．4糖基化和保守性分析

2．3．5受体与配体结合的初步探索

2．3．6 S蛋白可能的融合机制

2．4小结与展望

2．4．1 小结

2．4．2展望

第3章蝙蝠CD26与MERS-RBD相互作用的结构与功能研究

3．1前言

3．2实验材料与方法

3．2．1实验材料

3．2．2实验方法

3．3实验结果

3．3．1不同种类batCD26的克隆构建、蛋白表达和纯化

3．3．2 batCD26与MERS-RBD亲和力的测定及结合实验、假病毒入侵实验

3．3．3Myotis davidii-CD26与MERS-RBD复合物的结晶、衍射数据收集和结构解析

3．3．4蝙蝠的地理分布位置

3．4小结与展望

3．4．1 小结

3．4．2展望

第4章猪cD26与MERS-RBD相互作用的结构与功能研究

4．1前言

4．2实验材料与方法

4．3实验结果

4．3．1 pigCD26的构建

4．3．2 pigCD26与MERS-RBD亲和力的测定及结合实验、假病毒入侵实验

4．3．3 pigCD26-SVS与MERS-RBD复合物的结晶、衍射数据收集和结构解析

4．3．4 MERS-CoV对其他物种可能的感染情况

4．3．5 MERS-CoV对猪的隐性感染

4．4小结与展望

4．4．1 小结

4．4．2展望

第5章单峰驼CD26与MERS-RBD相互作用的结构与功能研究

5．1前言

5．2实验材料与方法

5．3实验结果

5．3．1 dromedaryCD26的构建

5．3．2 dromedaryCD26及其突变体的蛋白表达纯化

5．3．3 dromedaryCD26与MERS-RBD亲和力的测定及结合实验、假病毒入侵实验

5．3．4 dromedaryCD26晶体衍射数据收集、结构解析和分析

5．4小结与展望

5．4．1小结

5．4．2展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果