纳米载体表面PEG化程度的控制及其在药物递送的研究

摘要

纳米药物载体可通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR)在肿瘤部位积累，增加药物的含量，提高效果，降低副反应，具有应用前景。纳米载体经注射入血液循环，易被单核吞噬系统(MPS)识别并摄取，并被清除。纳米药物载体表面涂覆聚乙二醇(PEG)，可通过空间立体障碍，减少血液中蛋白吸附。目前已经上市和具有临床转化前景的纳米载体几乎都经过PEG化修饰，如Genexol-PM胶束化紫杉醇药物，聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段聚合物组成的荷载紫杉醇的纳米颗粒NK105。纳米载体PEG化（如表面PEG长度和密度）程度对其生物学行为产生显著影响，但高分子纳米载体表面的PEG化程度的控制一直未能有效解决，难以客观评价高分子聚合物纳米载体PEG化程度对体内命运影响的规律。本论文旨在调控高分子纳米药物载体的表面PEG化程度，在减少对其它纳米特性的干扰情况下，研究纳米药物载体表面PEG化程度对其体内生物学行为的影响，并应用于药物递送研究。论文的主要内容和结论如下:
　　1、发展了调控聚合物纳米颗粒表面PEG密度不同、其它纳米特性相近的方法，并系统研究了表面PEG密度对纳米颗粒体内生物学行为的影响。通过将聚己内酯(PCL)均聚物掺入到PEG-PCL共聚物中，并更改掺入比例，可调控纳米颗粒的表面PEG密度，然而单个纳米粒子的体积也随之变化，且体积变化与己内酯单元(CL)和乙二醇单元(EG)的摩尔比呈正线性相关;结合改变PEG-PCL中PCL嵌段的分子量，可获得粒径和表面PEG密度均改变的纳米颗粒库，从而挑选表面PEG密度不同而粒径等其它纳米特性相近的纳米颗粒。进一步对平均粒径为～100nm的一系列表面PEG（PEG分子量为3400）密度不同的纳米载体的研究发现，高PEG密度修饰的纳米颗粒具有长循环效应;在MDA-MB-231-GFP乳腺癌及皮下B16植入型黑色素瘤小鼠模型中，增大PEG密度，能够显著增加纳米颗粒在肿瘤中的富集含量，弥补了其不利于被肿瘤细胞摄取缺点，从而增强药物递送的抗肿瘤效果。
　　2、获得了表面PEG长度不同、其它纳米特性相近的系列纳米颗粒，研究了表面PEG长度对纳米颗粒体内生物学行为的影响。在前述基础上，通过改变PEG-PCL两亲性聚合物中PEG的分子量，可进一步获得表面PEG长度、PEG密度、粒径等纳米特性均改变的纳米颗粒库，从而获得PEG长度不同、其它纳米特性相近的纳米颗粒。在排除其它纳米特性干扰的情况下，发现纳米颗粒的体内生物学行为随着颗粒表面PEG长度的增加并非单一性变化。以末端PEG密度为～0.40PEG/nm2和前端PEG密度为～0.16PEG/nm2，且流体力学直径均在～100nm，表面电势在-2mV的纳米颗粒为例，当PEG的分子量从3400增加到8000Da时，纳米颗粒的体内末端清除半衰期显示循环时间先显著延长再急剧缩短;在MDA-MB-231-GFP乳腺癌和B16黑色素瘤小鼠皮下植入瘤模型中，用上述纳米载体递送多西紫杉醇，发现相应的肿瘤组织中积累的药物含量及其抗肿瘤效果趋势与其体内循环时间的规律相同。其中，PEG分子量为5000Da时，纳米颗粒与血清蛋白的相互作用较低，被MPS捕获量减少，具有较长的血液循环时间及肿瘤积累，疗效较好。
　　3、利用PEG化阳离子脂质辅助的纳米颗粒递送了免疫抑制分子缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎。将聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、阳离子脂质（DOTAP、BHEM-Chol）和小分子免疫抑制分子（他克莫司，FK506）共同组装成阳离子脂质辅助的纳米颗粒(CLAN)，其尺寸在110nm左右，表面电势为35mV，表面PEG密度为0.8PEG/nm2。该纳米颗粒在模拟胃液和肠液的pH条件下稳定，且能有效释放荷载药物;灌胃给药后，CLAN与负电黏液蛋白相互作用，有效滞留在炎性结肠部位，并穿透肠上皮细胞层，增强免疫抑制药物的作用效果，缓解肠炎症状，降低髓过氧化物酶(MPO)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌，抑制肠炎导致的小鼠体重下降。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 癌症治疗的现状和瓶颈

1．2 纳米载药系统

1．2．1 纳米载药系统的定义

1．2．2 纳米载药系统的分类

1．3 纳米载体所具有的各种特性及其影响

1．3．1 纳米载体具有的各种纳米特性

1．3．2 不同纳米特性对其颗粒体内命运的影响

1．4 纳米特性对载体生物学特性影响的研究面临的困境

1．5 本课题的选题目的及主要研究内容

参考文献

第二章 聚合物纳米颗粒表面PEG密度的调控及其对体内生物学效应的影响

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 主要材料

2．2．2 细胞株

2．2．3 实验动物

2．3 实验方法

2．3．1 聚合物纳米颗粒的制备

2．3．2 纳米颗粒的粒径分布及表面电势测定

2．3．3 纳米颗粒的平均分子质量测定

2．3．4 纳米颗粒的形貌观察

2．3．5 代谢动力学测定

2．3．6 蛋白吸附实验

2．3．7 肝脏和脾脏中纳米颗粒定量

2．3．8 体外细胞摄取纳米颗粒及定量

2．3．9 肿瘤组织中纳米颗粒定量

2．3．10 体内肿瘤细胞摄取纳米颗粒及定量

2．3．11 肿瘤抑制

2．4 结果与讨论

2．4．1 调控纳米颗粒尺寸及表面PEG密度

2．4．2 制备PEG密度不同而粒径相同的纳米颗粒

2．4．3 高PEG密度显著延长纳米颗粒体内循环时间

2．4．4 高PEG密度增强纳米颗粒在肿瘤部位富集

2．4．5 高PEG密度增强体内肿瘤细胞对纳米颗粒摄取

2．4．6 高PEG密度增强载药纳米颗粒抗肿瘤作用

2．5 本章小结

参考文献

第三章 聚合物纳米颗粒表面PEG长度对其体内生物学效应的影响

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 主要材料

3．2．2 动物

3．3 实验方法

3．3．3 PCL-RhoB荧光标记及载药(DTXL)纳米颗粒的制备

3．3．4 动态光散射仪检测纳米颗粒稳定性

3．3．5 细胞培养及传代

3．3．8 MDA-MB-231-GFP乳腺癌模型构建

3．3．9 B16黑色素瘤小鼠模型构建

3．3．12 黑色素瘤小鼠生长周期实验

3．3．13 肿瘤生长抑制实验

3．3．16 流式细胞仪分选MDA-MB-231-GFP乳腺癌细胞

3．3．17 分离不同PEG长度纳米颗粒表面的吸附蛋白

3．3．19 激光共聚焦显微镜(LSCM)检测纳米颗粒进入MDA-MB-231细胞的能力

3．3．20 肿瘤组织冰冻切片

3．3．21 免疫组化

3．4 结果与讨论

3．4．1 调控表面不同PEG长度纳米颗粒的尺寸

3．4．2 调控不同PEG长度纳米颗粒的表面PEG密度

3．4．3 不同PEG长度而其它特性相同的纳米颗粒性质表征

3．4．4 不同PEG长度而其它纳米特性相同的纳米颗粒药物代谢动力学

3．4．5 不同PEG长度而其它纳米特性相同的纳米颗粒肿瘤富集和肿瘤抑制

3．5 本章小结

参考文献

第四章 阳离子脂质辅助荷载他克莫司的药物载体用于溃疡性结肠炎治疗

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 主要材料

4．2．2 主要药品及试剂

4．2．3 动物

4．3 实验方法

4．3．1 纳米颗粒制备及表征

4．3．2 纳米颗粒载药(FK506)量检测

4．3．3 体外药物释放

4．3．4 诱导结肠炎小鼠模型

4．3．5 结肠部位颗粒富集

4．3．6 结肠组织中纳米颗粒分布

4．3．7 脂质辅助载药(FK506)纳米颗粒体内治疗实验

4．3．8 MPO和TNF-α分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 脂质辅助荷载他克莫司FK506纳米颗粒的制备及性状表征

4．4．2 体外胃肠环境模拟纳米载体中他克莫司FK506药物释放

4．4．3 阳离子脂质辅助的纳米颗粒CLANs增强结肠部位颗粒富集

4．4．4 阳离子脂质辅助的纳米颗粒CLANs增强结肠部位粘膜吸附能力

4．4．5 阳离子脂质辅助的纳米颗粒CLANs减缓葡聚糖硫酸钠DSS诱导的结肠炎恶化程度

4．4．6 组织学分析阳离子脂质辅助的纳米颗粒CLANs抑制结肠组织损伤

4．5 本章小结

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果