蛋白质主链以及甲基认证的核磁共振方法学研究

摘要

溶液核磁共振技术是在生理状态下研究蛋白质结构、相互作用以及动力学性质的重要手段之一。蛋白质主链或者侧链甲基的核磁共振信号认证（又称信号指认或者信号归属）是溶液核磁共振技术进行这些研究的第一步，通常也是最难的步骤。蛋白质的主链核磁共振信号能提供数量庞大的核磁共振探针，但是这种信号的灵敏度会随着蛋白质分子量的增大而迅速衰减，而侧链甲基的核磁共振信号数目虽然不及主链，甲基优秀的横向弛豫性质使其即使在超大蛋白质体系中也仍旧能通过核磁共振技术检测到。因此，对蛋白质的主链以及甲基核磁共振信号进行认证，能提供不同数量的，不同分子尺度下的氨基酸层面的结构、相互作用以及动力学信息。
　　对于分子量大于30kDa的蛋白质，由于13Cβ原子的快速横向弛豫以及13Cα原子的的化学位移高度简并，即使结合全氘代、横向弛豫优化实验等众多用来减小横向弛豫速率的核磁共振技术，也很难对主链进行高完成度、高准确率的认证。虽然目前能进行蛋白质甲基核磁共振认证的方法有很多，但是这些方法都有一定的局限性，尤其是对于分子量在30kDa-50kDa的蛋白质，目前没有哪种通用的认证方法能单独地、高完成度地、高准确率地、高效地去进行甲基认证。对此，我们提出了一种协方差LCC的认证方法，这种方法仅仅只需要一个蛋白质样品就能高完成度、高准确率、高效地同时完成主链以及甲基的核磁共振信号认证。
　　这种协方差LCC的方法选取了灵敏度最高的主链核磁共振谱图HN(CO)CA&HNCA以及甲基核磁共振谱图CA-TOCSY-(CM)HM&methyl-HMQC作为原始谱图，因此从很大程度上缓解了蛋白质分子量增大带来的信号衰减问题。通过沿着贡献维度13Cα、13Cα、1HM分别构造HN(CO)CA与HNCA、HNCA与CA-TOCSY-(CM)HM、CA-TOCSY-(CM)HM与methyl-HMQC的协方差谱图，协方差LCC的方法巧妙的将传统的主链或者甲基认证方法中，利用这些谱图对之间的13Cα、13Cα或者1HM化学位移进行匹配认证时遇到的多重认证问题转化为了协方差谱图中伪峰识别的问题。我们将峰形线性相关系数(LCC)作为伪峰筛选的标准，这种LCC筛选标准能过滤近90％的协方差谱图中的伪峰，这意味着通过这种协方差LCC的方法能解决近90％的多重认证问题。
　　我们在Matlab上构建了利用这种协方差LCC的方法进行主链以及甲基认证的算法，并利用其高完成度、高准确率地认证了306.6K U-[2H，13C，15N]-MBP、302.6K U-[1H，13C，15N]-TRIM66蛋白质的主链核磁共振信号以及306.6K U-[2H,13C,15N]-[I(δ1 only)]-MBP、283.6K U-[2H,13C,15N]-[I(δ1 only), LproR, VproR]-MBP蛋白质的甲基核磁共振信号。

目录

声明

摘要

第1章 蛋白质主链及甲基核磁共振信号认证方法

1．1 引言

1．2 蛋白质主链核磁共振信号认证方法

1．2．1 基于1H同核核磁共振谱的蛋白质主链认证

1．2．2 基于15N，13C异核多维核磁共振谱的蛋白质主链认证

1．2．3 基于2H标记的蛋白质主链认证

1．2．4 基于主链TROSY技术的蛋白质主链认证

1．2．5 基于主链CRINEPT技术的蛋白质主链认证

1．2．6 基于核磁共振快速采样技术的蛋白质主链认证

1．2．7 基于协方差矩阵核磁共振技术的蛋白质主链认证

1．3 蛋白质甲基核磁共振信号认证方法

1．3．1 甲基TROSY效应简介

1．3．2 基于传统TOCSY和COSY技术的蛋白质甲基认证

1．3．3 基于“分而治之”方法的蛋白质甲基认证

1．3．4 基于点突变的蛋白质甲基认证

1．3．5 基于甲基空间距离网络的甲基认证

第2章 利用协方差LCC方法进行大蛋白质主链认证

2．1 研究背景

2．1．1 大蛋白质主链认证方法总结

2．1．2 协方差谱伪峰识别方法的现状

2．1．3 协方差LCC伪峰识别方法提出

2．2 实验样品的准备

2．2．2 2H，15N，13C标记的MBP蛋白质的表达与纯化

2．2．3 核磁共振样品准备

2．3 核磁共振实验

2．3．1 快速采样实验数据采集和处理

2．3．2 均匀采样实验数据采集和处理

2．4 利用协方差LCC方法进行主链认证的流程

2．4．1 计算真实协方差谱信号峰LCC值的流程

2．4．2 计算虚拟协方差信号列表LCC值的流程

2．4．3 利用协方差LCC方法进行主链认证的流程

2．4．4 基于协方差LCC方法的半自动认证算法介绍

2．5 实验结果

2．5．1 协方差LCC方法的可靠性验证

2．5．2 影响LCC值的因素

2．5．3 协方差LCC方法与其他方法优劣性比较

2．5．4 利用协方差LCC方法认证MBP蛋白质主链

2．5．5 利用协方差LCC方法认证TRIM66蛋白质主链

2．6 课题总结与讨论

第3章 利用协方差LCC方法进行大蛋白质甲基认证

3．1．1 甲基探针在核磁共振中的应用

3．1．2 现行甲基认证方法的优劣

3．1．3 利用协方差LCC的方法进行甲基认证的思路

3．2 实验样品的准备

3．2．1 甲基标记技术介绍

3．2．2 [I(δ1 only)，L(13CH3，13CH3)，V(13CH3，13CH3)]MBP表达与纯化

3．2．3 [I(δ1 only)]MBP蛋白质的表达与纯化

3．2．4 [I(δ1 only)，LproR，VproR]MBP蛋白质表达与纯化

3．3 核磁共振实验

3．3．1 构建主链1H，15N到13Cα关联

3．3．2 构建13Cα到甲基1HM的关联

3．3．3 构建1Hm到甲基13Cm的关联

3．3．4 实验数据采集和处理

3．4 计算甲基相关协方差谱谱峰LCC值流程

3．4．1 改进的LCC值计算方法

3．4．2 [1H，15N]-13Cα与13Cα-1HM协方差谱LCC值计算

3．4．3 13Cα-1HM与13Cm-1HM协方差谱LCC值计算

3．5 实验结果

3．5．1 构造1H，15N到13Cα关联的各种脉冲的相对灵敏度

3．5．2 构建13Cα到甲基1HM关联的各种脉冲的相对灵敏度

3．5．3 306．6K和283．6K下MBP蛋白质甲基和主链参照认证的获取

3．5．4 306．6K下[I(δ1 only)]MBP的甲基认证

3．5．5 283．6K下[I(δ1 only)，LproR，VproR]MBP的甲基认证

3．6 课题总结与讨论

第4章 快速采样平台的构建

4．1 基于SCRUB／CELAN算法的非均匀采样平台构建

4．1．1 四维和三维非均匀采样实验

4．1．2 基于SCRUB算法的数据处理平台构建

4．2 基于APSY技术的快速采样平台构建

4．2．1 5D／6D／7D APSY脉冲序列准备

4．2．2 APSY实验的设置

4．2．3 APSY数据的处理

4．3 基于SCRUB和APSY快速采样实验的CYANA-FLYA自动认证

4．4 核磁共振实验

4．5 实验结果与讨论

4．5．1 CYANA-FLYA自动认证在MBP样品的调试

4．6 课题总结与讨论

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果