四硫代钼酸铵抑制顺铂与人铜伴侣蛋白Atox1的相互作用

摘要

顺铂是临床上广泛使用的抗癌药物。它通过与细胞核内DNA结合造成DNA损伤，诱导细胞凋亡。但是，只有少量的顺铂能进入细胞核并与DNA结合。越来越多的研究表明，一些与铜转运相关的蛋白质可以与顺铂结合，导致进入细胞核内的顺铂减少。铜伴侣蛋白Atox1被认为与细胞内顺铂的转运相关。最近晶体结构研究表明Atox1的CXXC(C为半胱氨酸)金属结构域可以直接与顺铂结合;细胞内核磁共振结果也证实了在细胞内Atox1蛋白与顺铂的结合。因此，Atox1蛋白被认为可以作为克服细胞对顺铂耐药性的药物作用靶点。
　　四硫代钼酸铵([(NH4)2MoS4]，TM)是临床上用于治疗Wi1son病的铜螯合剂。TM能够通过降低铜的含量抑制肿瘤周边血管的产生，从而抑制肿瘤生长。它也可以与血清白蛋白、铜蓝蛋白和金属硫蛋白等多种铜蛋白结合，调节铜的含量。值得注意的是多项研究表明，TM可以通过选择性的增加肿瘤组织中的DNA铂化量来增强顺铂的癌症治疗效果;同时TM也可以减弱细胞对顺铂的耐药性;但是，这种协同作用的产生原因并不清楚。有研究提出TM和顺铂的协同作用可能是由于TM的铜螯合能力。最近，X射线晶体结构显示TM可以与酵母铜伴侣蛋白Atx1结合，形成稳定的[TM·Cu·(Cu-Atx1)3]复合物。有趣的的是，Atx1是人铜分子伴侣蛋白Atox1的类似物，而人铜伴侣蛋白Atox1被认为与顺铂的耐药性有关。基于这些发现，我们推测TM可能干扰Cu-Atox1与顺铂之间的相互作用，因此降低细胞对顺铂的耐药性。
　　在本文中，我们研究了TM对Cu-Atox1与顺铂反应的影响。结果证实了TM与溶液中的Cu-Atox1反应可以形成三聚体，并抑制Cu-Atox1的铂化。此外，TM能够抑制顺铂诱导的Cu-Atox1的解折叠和聚集。同时，我们也使用了apo-Atox1和Ag-Atox1作为Cu-Atox1的对照。有趣的是，TM在相同实验条件下只能抑制Cu-Atox1的铂化，而不能阻止apo-Atox1、Ag-Atox1与顺铂的反应。该结果表明以Cu-S-Mo为中心的三聚体复合物的形成是TM抑制顺铂与Cu-Atox1反应，进而克服依赖Atox1蛋白的顺铂耐药性的关键因素。这些结果有助于了解TM和顺铂在癌症化疗中的协同作用。
　　第一章首先对铂类药物的抗癌机理做了文献综述。然后，重点介绍了铂类抗癌药物与铜转运蛋白的相互作用。主要包括铜摄取蛋白Ctr1、铜伴侣蛋白Atox1和铜泵出蛋白ATPae的结构和功能，以及它们在铂转移中发挥的重要作用。最后介绍了四硫代钼酸铵单独在药物作用方面的研究现状，以及四硫代钼酸铵与顺铂联合给药的相关研究。
　　第二章中，我们研究了TM对顺铂与Cu-Atox1反应的影响。色谱分析和电喷雾质谱证实了TM可以抑制顺铂与Cu-Atoxl的相互作用。二维核磁共振和圆二色谱实验表明TM会抑制顺铂诱导的Cu-Atoxl的解折叠。聚丙烯酰胺凝胶电泳方法证实了TM可以抑制顺铂诱导的Cu-Atoxl的聚集。同时用apo-Atoxl（没有结合铜的Atox1蛋白）与Ag-Atoxl（结合Ag的Atox1蛋白）作为对照，发现在相同实验条件下，TM并不会抑制顺铂与apo-Atoxl、Ag-Atoxl的反应。这一对照试验结果表明，TM-Cu-Atoxl化合物中Cu-S-Mo结构对TM的抑制作用起了关键作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 铂类抗癌药物

1．1．1 引言

1．1．2 顺铂的发现

1．1．3 新型铂类抗癌药物

1．1．4 铂类药物的抗癌机理

1．2 铜转运蛋白与铂类抗肿瘤药物

1．2．1 引言

1．2．2 铜摄取蛋白Ctr1与顺铂的细胞摄取

1．2．3 铜伴侣蛋白Atox1与顺铂的细胞转运

1．2．3 P型ATP酶与顺铂的外排

1．3 四硫代钼酸铵的药物治疗

参考文献

第二章 四硫代钼酸铵抑制顺铂与人铜伴侣蛋白Atox1的相互作用

2．1 引言

2．2 实验材料和方法

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 质粒构建

2．2．4 Atox1蛋白的表达和纯化

2．2．5 电泳分析实验

2．2．6 分子排阻实验

2．2．7 阴离子交换色谱实验

2．2．8 电喷雾质谱实验

2．2．9 二维核磁共振实验

2．2．10 圆二色谱实验

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 TM-Cu-Atox1复合物的制备

2．3．2 非变性电泳和分子排阻色谱法检测三元复合物的形成

2．3．3 阴离子交换色谱检测TM对Cu-Atox1与顺铂反应的影响

2．3．4 电喷雾质谱检测TM对Cu-Atox1与顺铂反应的影响

2．3．5 15N-HSQC检测TM对顺铂诱导的Cu-Atox1蛋白解折叠的影响

2．3．6 圆二色谱法检测TM对顺铂诱导的Cu-Atox1蛋白解折叠的影响

2．3．7 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测TM对顺铂诱导的Cu-Atox1蛋白聚集的影响

2．3．8 TM对顺铂与apo-Atox1和Ag-Atox1反应的影响

2．4 本章总结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果