通过使用MBP标签高水平原核表达纯化死亡结构域家族蛋白及炎症小体NLRP1与ASC的结构生物学研究

摘要

一、通过使用MBP标签高水平原核表达纯化死亡结构域家族蛋白
　　死亡结构域超家族是最大的结构域超家族之一，在细胞凋亡、炎症和先天免疫信号通路中起重要作用。由于死亡结构域能够介导蛋白质-蛋白质之间的相互作用，所以它们在体外过量表达时是非常难以处理的。在本研究中，我们发现麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签蛋白在改善许多死亡结构域超家族成员的行为方面是非常有效果的。为了在大肠杆菌中实现死亡结构域超家族的高水平表达，我们基于pET30a载体的主链设计了两种MBP标记的表达载体:一种是具有柔性的连接且不可切割，另一种是具有烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切位点且可以切割。通过HisTrapTM IMAC（镍柱）和Superdex-200凝胶过滤柱（分子筛）从细胞裂解物中纯化可溶性目的蛋白。我们尝试了死亡结构域超家族的七个目标蛋白，包括二个PYD、三个CARD和两个DD。我们用这两种载体成功表达并纯化这些死亡结构域家族蛋白，得到了可溶且高质量的蛋白质，其中三种蛋白质成功结晶。我们的研究结果表明，两种MBP融合表达载体均能够显著增强融合蛋白的产量和可溶性，并且能够帮助目的蛋白结晶。
　　二、炎症小体NLRP1与ASC的结构生物学研究
　　人体的先天免疫系统包含了几种模式识别受体家族，它们通过多种机制启动对微生物感染的免疫应答反应。NOD样受体(NLR)是一类在细胞质中表达的模式识别受体，它由人类基因组中的约20个成员组成。NLRP1是NOD样受体(NLR)家族中最先发现的一员，也被称作CARD7、CIDED、DEFCAP和SLEV1。NLRP1主要由NACHT、NAD、LRR、FIIND和CARD五个结构域组成，而人源NLRP1(hNLRP1)比鼠源NLRP1(mNLRP1)多一个PYD结构域。当机体受到外界病原体侵染时，被激活的NLRP1通过其CARD结构域招募下游的ASC和Caspase-1，从而形成NLRP1炎症小体，并最终介导细胞焦亡和细胞因子IL-1β、IL-18的成熟，引起机体的炎症反应。
　　目前，NLRP1炎症小体具体的活化分子机制仍未可知。因此，本论文旨在通过研究hNLRP1和hASC的相互作用，从而探究hNLRP1炎症小体的具体活化分子机制和其在体内的生物学功能。通过构建以MBP为标签蛋白的重组表达载体，表达并纯化了相应的融合蛋白。我们发现hNLRP1-CARD结构域在溶液和酵母中都有自我相互作用，通过定点突变确认了同型相互作用界面。此外，通过酵母双杂交和突变实验验证hNLRP1-CARD的二聚体界面可能对其与hASC-CARD相互作用是必须的。最后，我们顺利解析得到了分辨率为2.8(A)的hASC-CARD晶体结构，其符合经典的CARD构型。我的论文研究为NLRP1炎性小体激活的分子机制提供了新的见解。

目录

声明

摘要

第—篇 通过使用MBP标签高水平原核表达纯化死亡结构域家族蛋白

1．1 重组蛋白简介

1．2 死亡结构域家族蛋白概述

第二章 实验材料、设备和方法

2．1 实验材料和实验设备

2．2 实验方法

3．1 表达载体的设计

3．2 死亡结构域家族蛋白的表达与纯化

3．3 死亡结构域家族蛋白的初步晶体学研究

3．4 课题总结

第二篇 炎症小体NLRP1与ASC的结构生物学研究

4．1 炎症概述

4．2 NLRs简介

4．3 NLRP1与自身免疫性疾病

4．4 研究方案及意义

5．1 实验材料

5．2 实验方法

第六章 结果与分析

6．1 hNLRP1与hASC的表达与纯化

6．2 hNLRP1与hASC结构基础的初步晶体学研究

6．3 hNLRP1与hASC之间的相互作用研究

6．4 课题总结和展望

参考文献

致谢

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