BTK激酶抑制剂QL47的新靶点发现及作用机理研究

摘要

热休克蛋白是维持肿瘤细胞内稳态的重要组分，通过稳定多种导致癌症的原癌蛋白如激酶和转录因子的三维结构，从而平衡癌症细胞的内环境，促进癌症发生发展。靶向于热休克蛋白能够干扰其客户蛋白的结构，造成其不稳定进而被泛素化标记，最终经由蛋白酶体途径降解，从而达到抗肿瘤的目的。目前针对热休克蛋白抑制剂的研究多集中于HSP90和HSP70，多数的HSP90抑制剂结合于HSP90的N端结构域，通过与ATP竞争结合HSP90来发挥作用，但是这类抑制剂会引发HSF1转录因子激活，造成热休克家族蛋白的转录水平升高，这种负反馈会减弱HSP90打击肿瘤细胞的效果。HSP70作为HSP90的伴侣蛋白，参与体内新生蛋白的折叠，维持蛋白的结构稳定，同时HSP70还具有抗凋亡的作用，能够帮助癌症细胞抑制凋亡的发生。双重抑制诱导型的HSP70和持续表达的HSC70能够阻断HSP90的功能，导致原癌蛋白的降解，同时还可以诱导肿瘤细胞凋亡。基于此，开发新型HSP70抑制剂将为癌症的诊疗增加新的手段和策略，具有重要的研究意义。 鉴于热休克蛋白与细胞内的多种蛋白，尤其是大量促进或驱动癌症的蛋白有相互作用，因此，建立基于HSP90的蛋白相互作用检测体系，能够检测热休克蛋白与客户蛋白之间的相互作用力，并表征小分子的结合强弱，可覆盖大部分在研的临床靶点，并且实现对一些无法开发生化检测手段的靶点进行检测。该体系的开发将有助于新药的研发和老药新用的筛选。 表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种跨膜的受体酪氨酸激酶，表皮生长因子Epidermal growth factor(EGF)与EGFR胞外区结合，导致其自磷酸化激活，并激活下游的信号通路。在我国致死率第一的恶性肿瘤是肺癌，非小细胞型肺癌约占我国肺癌发病率的80％，而在10％-35％的非小细胞肺癌患者中，会出现EGFR的突变，主要为19号外显子的缺失突变以及L858R点突变，这两种突变都会造成EGFR非依赖EGF的异常活化，持续驱动肿瘤的发生发展。针对EGFR活化的非小细胞肺癌，第一代的EGFR抑制剂吉非替尼，厄洛替尼的持续用药会诱发EGFR的T790M突变的产生，这种突变会导致患者对一代抑制剂产生耐药性。因此开发EGFR T790M的不可逆的高选择性抑制剂可以克服耐药性，为非小细胞肺癌患者提供新的用药选择。 第一部分:BTK抑制剂QL47的新靶点发现 QL47为激酶BTK的不可逆抑制剂，在进行高通量筛选的过程中，我们发现QL47在抗增殖实验筛选中对于FLT3-ITD突变型的AML细胞具有很强的效果，而我们之前的研究显示敲除BTK对于FLT3-ITD突变的细胞增殖没有明显的抑制作用，因此我们怀疑QL47具有其他的靶点，检测FLT3信号通路，我们发现FLT3-ITD在QL47作用下，蛋白发生降解，我们怀疑QL47是通过干扰了热休克蛋白辅助蛋白折叠的功能，影响了FLT3-ITD蛋白的稳定性导致其降解。我们利用47-Biotin探针发现QL47结合HSP70蛋白的N端结构域，通过LC-MS验证了QL47不可逆结合于HSP70的C267位点。QL47能够影响HSP70的蛋白重折叠功能，但是对于HSP70的ATPase功能没有抑制，这表明QL47与HSP70的结合方式有别于传统的HSP70抑制剂VER155008，是一种新型的HSP70抑制剂。QL47作为新型的HSP70抑制剂，为今后的HSP70抑制剂的开发奠定了理论和结构基础， 第二部分QL47针对FLT3突变白血病的抗肿瘤机制研究 QL47抑制了FLT3突变的白血病细胞的机制主要是通过导致FLT3突变蛋白的降解，进而抑制下游的STAT5-MYC信号通路，从而体现了良好的FLT3突变的白血病细胞系的抗增殖效果。同时HSP70在肿瘤细胞内起到重要的抗凋亡作用，抑制了HSP70能够导致抗凋亡因子XIAP的降解，进而导致细胞凋亡的发生，并且能够将细胞周期阻滞在G0-G1期。我们在BAF3-FLT3mutant转基因细胞系上测试了QL47对于FLT3各种突变蛋白的影响，结果显示QL47不仅能够降解FLT3-ITD蛋白，并且对于各种激活突变以及耐药性突变也都有较强的降解作用比如N676D和F691L。最后，我们在原代病人细胞以及小鼠移植瘤模型上都观测到了QL47能够有效的抑制肿瘤的增殖。因此，QL47为FLT3-ITD突变的急性白血病的治疗提供了新的策略，并且在克服激酶耐药性方面具有很大的潜力。 第三部分:基于HSP90的蛋白相互作用检测体系的建立 评估药物与其靶点在生理环境中的相互作用是临床前药物研究中的需要面对的重要一环。鉴于HSP90在细胞中与多数激酶都有相互作用，并且稳定其结构，而小分子结合激酶后能够降低激酶与HSP90的结合。基于此原理，我们拟建立基于HSP90的蛋白相互作用检测体系，此体系以Split luciferase Complementation assay为基础，以荧光素酶的活性表征HSP90与激酶之间相互作用强弱，此体系能够覆盖多数与癌症相关的激酶靶点以及部分转录因子靶点，能够实现高通量筛选以发现有结合的小分子，并且能够对其结合力进行定量分析，是课题组已经建立的基于癌症激酶靶点的BaF3高通量细胞筛选库的补充和拓展，为高通量筛选提供了新的手段，能够提高老药新用以及新药筛选的效率。 第四部分:EGFR选择性抑制剂CHMFL-EGFR-26的发现及研究 研究团队在之前的研究中通过高通量筛选发现BTK激酶抑制剂依鲁替尼具有一定的EGFR T790M的抑制活性，以此结构为基础，研究团队对依鲁替尼的结构进行了优化，得到了靶向于外显子19的缺失突变，L858R点突变以及T790M突变型的EGFR不可逆抑制剂CHMFL-EGFR-26，该化合物采用一种新型的DFG-in-cHelix-out结合模式，在非小细胞肺癌肿瘤细胞系上的测试结果显示，CHMFL-EGFR-26在EGFR野生型及突变型细胞系之间取得了较好的选择性，在不影响EGFR野生型的情况下，能够有效抑制突变型细胞的增殖并且导致细胞凋亡的产生，同时小鼠模型实验结果显示，CHMFL-EGFR-26能够明显抑制两种EGFR驱动的非小细胞肺癌的移植瘤的生长。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1热休克蛋白的抑制剂的研究意义

1．1．1热休克蛋白的简介

1．1．2热休克蛋白在癌症发生发展中发挥的作用

1．1．3热休克蛋白抑制剂的研究现状

1．2急性白血病的背景介绍以及研究现状

1．2．1急性白血病的流行病学分析

1．2．2急性白血病治疗手段

1．3基于热休克蛋白的蛋白相互作用检测体系的原理和开发意义

1．3．1 HSP90与激酶的结合模式

1．3．2基于HSP90的蛋白相互作用体系设计原理

1．3．3基于HSP90的蛋白相互作用体系的开发意义

1．4 EGFR抑制剂的研究意义

1．4．1 EGFR激酶简介及其在癌症中发挥的作用

1．4．2 EGFR激酶抑制剂的研究现状

1．5研究目标

参考文献

第二章BTK激酶抑制剂QL47的新靶点的发现

2．1引言

2．2实验材料与方法

2．3实验结果

2．3．1高通量筛选发现目标化合物QL47的新功能

2．3．2 QL47能够降解包括FLT3-ITD在内的多种激酶

2．3．3利用探针分子和蛋白组学研究手段找寻与QL47有相互作用的蛋白

2．3．4 QL47与HSP70结合模式的研究

2．3．5在体外研究QL47与HSC70的结合能力

2．3．5 QL47对HSP70 ATPase活性的影响

2．3．6 QL47对HSP70蛋白重折叠功能的影响

2．3．7 QL47对热休克因子(Heat shock transcription Factor1)的影响

2．3．8分子对接预测QL47与HSP70结合模式

2．4结论与讨论

参考文献

第三章HSP70抑制剂QL47针对FLT3突变白血病的药理学研究

3．1引言

2．2实验材料与方法

3．3实验结果

3．3．2 QL47对FLT3-ITD-STAT5-MYC信号通路的影响

3．3．3 QL47对FLT3-ITD突变的急性白血病的细胞凋亡的影响

3．3．4 QL47对FLT3-ITD突变的急性白血病的细胞周期的影响

3．3．5 QL47能降解多种耐药突变和激活突变FLT3蛋白

3．3．6测试QL47对FLT3-ITD病人细胞的影响

3．3．7在MV-4-11介导的小鼠移植瘤模型上测试QL47的药效

3．4结论与讨论

参考文献

第四章：基于HSP90的蛋白相互作用检测体系的建立

4．1引言

4．2实验材料与方法

4．3实验结果

4．3．1体系基本设计思路

4．3．2体系条件的优化及调整

4．3．3体系的应用

4．4结果与讨论

参考文献

第五章EGFR的高选择性抑制剂CHMFL-EGFR-26的开发

5．1引言

5．2实验材料与方法

5．3实验结果

5．3．1 EGFR突变抑制剂CHMFL-EGFR-26的分子设计及筛选

5．3．2 CHMFL-EGFR-26的选择性分析

5．3．3 CHMFL-EGFR-26选择性的抑制EGFR突变的非小细胞肺癌细胞的增殖

5．3．4 CHMFL-EGFR-26能够抑制非小细胞肺癌的EGFR信号通路

5．3．5 CHMFL-EGFR-26能够诱导非小细胞肺癌凋亡并阻滞其细胞周期

5．3．6 CHMFL-EGFR-26在H1975和PC9细胞异种移植的小鼠模型上体现了良好的药效

5．4实验结果讨论

参考文献

总结与展望

致谢

在读期间发表的学术论文