针对ALK/EGFR激酶双重抑制剂的药物学研究

摘要

随着分子生物学、肿瘤生物学及其相关学科的深入发展，靶向药物（分子/基因层面）逐渐成为研究热点，越来越多的靶向药物应用于临床治疗。与传统肿瘤治疗方式（手术、放疗、化疗等）相比，靶向药物不良反应相对较少，抗肿瘤疗效相对较高，不仅能够延长部分患者的生存期，对于患者生存质量改善良多，为众多癌症患者带来新的希望。本论文主要围绕ALK/EGFR双重激酶抑制剂、CDK9激酶抑制剂以及BCR-ABL/V299L耐药性突变激酶抑制剂的理性设计和药物作用机制及克服耐药性等方面展开研究。 第一章针对非小细胞肺癌ALK/EGFR共存型患者的高活性高选择性双重激酶抑制剂CHMFL-ALK/EGFR-050的发现研究 近年来临床中观察到越来越多的EGFR突变和ALK重组共存型的非小细胞肺癌(NSCLC)病人出现，但是对于这些患者仍然缺乏有效的单剂治疗方案。我们从ALK激酶抑制剂TAE684（化合物14）开始，开发得到了一种高效的ALK/EGFR激酶双重抑制剂CHMFL-ALK/EGFR-050（化合物18），该化合物能够抑制EGFR L858R、T790M、del19突变以及EML4-ALK、L1196M、R1275Q、C1156Y、F1174L突变的生化活性;与此同时CHMFL-ALK/EGFR-050(化合物18)能够显著抑制EGFR突变体和EML4-ALK驱动的非小细胞肺癌细胞系增殖。细胞水平检测发现CHMFL-ALK/EGFR-050(化合物18)能够影响EGFR和ALK介导的信号通路，诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G0/G1阶段。此外，体内实验发现CHMFL-ALK/EGFR-050（化合物18）能够抑制H1975细胞系小鼠异体瘤移植模型(40mg/kg/d，TGI:99％)和H3122细胞系小鼠异体瘤移植模型(40mg/kg/d，TGI:78％)中肿瘤的生长。上述结果说明:CHMFL-ALK/EGFR-050（化合物18）有可能作为治疗ALK/EGFR共存型非小细胞肺癌的潜在候选药物进行后续研究及开发。 第二章针对头颈癌的高活性高选择性双重激酶抑制剂CHMFL-ALK/EGFR-039的探索研究 EGFR在头颈癌中表达率高达90％，临床治疗中采用EGFR激酶靶向药物治疗头颈癌时存在临床响应率较低等问题。曾有研究报道同时使用ALK激酶抑制剂和EGFR激酶抑制剂能够提高对头颈癌细胞系的作用效果，因此开发双靶点激酶抑制剂/单药对于提高头颈癌临床治疗效果或有所助益。我们通过药物结构设计和筛选得到了一个新的ALK/EGFR双靶点激酶抑制剂 CHMFL-ALK/EGFR-039。在生化检测中CHMFL-ALK/EGFR-039对于一系列头颈癌细胞抗增殖效果明显，与此同时检测发现CHMFL-ALK/EGFR-039能够影响EGFR和ALK介导的信号通路，诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G2/M阶段。此外，体内研究发现CHMFL-ALK/EGFR-039能够抑制HSC-3细胞系小鼠异体瘤移植模型(100mg/kg/d，TGI:87.6％)和CAL27细胞系异体瘤移植模型(100mg/kg/d，TGI:65.8％)中肿瘤的生长。这些实验结果说明:CHMFL-ALK/EGFR-039有可能作为治疗头颈癌患者的潜力候选药物进行后续研究及开发。 第三章针对CDK9激酶的高活性高选择性抑制剂CHMFL-CDK-150的发现研究 CDK激酶家族成员CDK9激酶是真核细胞中转录延伸的关键调节因子，作为肿瘤治疗和其他疾病治疗的重要靶点，近年来受到越来越多的关注。现有的CDK9激酶抑制剂存在CDK激酶间选择性不高、毒副作用大等问题。我们通过药物结构设计和筛选得到了一个新的高活性高选择性CDK9激酶抑制剂JSH-150（化合物39）。在生化检测中JSH-150对于CDK9激酶活性在nM级别;与已知的CDK9激酶抑制剂相比，JSH-150（化合物39）在CDK亚家族间表现出较高的选择性，在与转录相关的CDK7和CDK9激酶间选择性超过1700倍;与此同时检测发现JSH-150对于一系列实体瘤（黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌、结直肠癌、肺癌）细胞系和白血病细胞系抗增殖效果明显，能够影响CDK9介导的信号通路(RNA PolⅡ、MCL-1、C-Myc)。此外，JSH-150能够诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G0/G1阶段。通过体内研究发现，10mg/kg用药剂量时JSH-150几乎可以完全抑制MV4-11细胞系小鼠异体瘤移植模型中肿瘤的生长，与此同时JSH-150在口服有效性检测和细胞毒性检测中均表现良好。上述实验结果说明:JSH-150可作为治疗白血病等系列癌症的潜在候选药物进行后续研究及开发。 第四章针对慢性髓细胞白血病V299L耐药突变的高活性高选择性BCR-ABL激酶抑制剂CHMFL-ABL-039的发现研究 在过去的十年中，BCR-ABL融合基因作为慢性髓细胞白血病(CML)的关键驱动基因，研究者们进行了靶向药物研究并成功得到了一些酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如伊马替尼、达沙替尼和博苏尼布等。这些激酶抑制剂的出现显著提高了临床治疗中CML患者的生存率。随着研究深入，在CML患者临床治疗中发现了越来越多具有激酶抑制剂抗性的耐药性突变，比如T315I、F317L、M315T、E255V、V299L等。尽管与出现频率较高的T315I耐药性突变相比，V299L仍然很少发生。然而随着高通量测序技术的应用，越来越多的的患者中发现了V299L突变的存在。与此同时个性化治疗概念的普及和推广，使得这些临床中的罕见突变（或孤儿药靶点）引起了越来越多的关注。因此我们利用药物化学方法找到一个针对V299L耐药突变的高活性高选择性BCR-ABL激酶抑制剂CHMFL-ABL-039。该化合物在全激酶组筛选中对于ABL激酶(IC50:7.9nM)和伊马替尼耐药性突变V299L(IC50:7.9 nM)均表现出较好的选择性(Sscore(1)=0.02)。此外CHMFL-ABL-039对于一系列BCR-ABL驱动的细胞系抗增殖活性明显，能够影响BCR-ABL介导的细胞信号通路;与此同时，CHMFL-ABL-039能够诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G0/G1阶段。通过体内研究发现，CHMFL-ABL-039在BaF3-BCR-ABL-V299L异体瘤小鼠移植模型和K562异体瘤小鼠移植模型中对于肿瘤进展的抑制效果优于伊马替尼。上述实验结果说明CHMFL-ABL-039可作为治疗CML（V299L突变）的潜在候选药物进行后续研究及开发。

目录

声明

摘要

第1章针对非小细胞肺癌中ALK／EGFR激酶双重抑制剂CHMFL-ALK／EGFR-050的发现研究

1．1研究背景

1．1．1肺癌简介

1．1．2非小细胞肺癌流行病学简介

1．1．3非小细胞肺癌分子分型简介

1．1．4表皮生长因子受体激酶EGFR和EGFR激酶抑制剂研究进展

1．1．5间变淋巴瘤激酶ALK

1．1．6ALK抑制剂研究进展

1．1．7 ALK／EGFR共存型病人研究现状

1．1．8研究背景总结

1．2实验材料与方法

1．2．1实验仪器、耗材及试剂

1．2．2实验方法

1．3实验结果

1．3．1 ALK／EGFR双重抑制剂CHMFL-ALK／EGFR-050的设计思路

1．3．2 CHMFL-ALK／EGFR-050对ALK及EGFR激酶活性检测

1．3．3 CHMFL-ALK／EGFR-050结合模式分析

1．3．4 CHMFL-ALK／EGFR-050在ALK及EGFR细胞系中细胞增殖活性检测

1．3．5 CHMFL-ALK／EGFR-050对ALK及EGFR介导的下游信号通路的影响

1．3．6 CHMFL-ALK／EGFR-050对细胞周期的影响

1．3．8 CHMFL-ALK／EGFR-050对小鼠异体移植瘤的影响

1．3．9 CHMFL-ALK／EGFR-050药代动力学研究

1．4结论和讨论

参考文献

第2章针对头颈癌ALK／EGFR激酶双重抑制剂CHMFL-ALK／EGFR-039的发现研究

2．1．1头颈癌简介

2．1．2头颈鳞癌及其靶向药物治疗研究进展

2．1．3研究背景小结

2．2实验材料与方法

2．2．1实验仪器、耗材及试剂

2．2．2实验方法

2．3实验结果

2．3．1 CHMFL-ALK／EGFR-039对ALK及EGFR激酶活性检测

2．3．2 CHMFL-ALK／EGFR-039在头颈癌细胞系中细胞增殖活性检测

2．3．3 CHMFL-ALK／EGFR-039对ALK及EGFR介导的下游信号通路的影响

2．3．4 CHMFL-ALK／EGFR一039对细胞周期的影响

2．3．5 CHMFL-ALK／EGFR-039对细胞凋亡的影响

2．3．6 CHMFL-ALK／EGFR-039对小鼠异体移植瘤的影响

2．4结论和讨论

参考文献

第3章针对CDK9激酶的高活性高选择性抑制剂JSH-150的发现研究

3．1研究背景

3．1．1 CDK家族简介

3．1．2 CDK9激酶及CDK9激酶抑制剂研究进展

3．1．3研究背景小结

3．2实验材料和方法

3．2．1实验仪器及耗材

3．2．2化合物来源

3．2．3实验材料

3．2．4实验方法

3．3实验结果

3．3．1 JSH-150是一个高活性高选择性的CDK9激酶抑制剂

3．3．2 JSH-150对细胞增殖活性的检测

3．3．3 JSH-150对CDK9介导的信号通路影响

3．3．4 JSH-150对细胞周期的影响

3．3．5 JSH-150对细胞凋亡的影响

3．3．6 JSH-150药代动力学研究

3．3．7 JSH-150抑制MV4-11异体移植瘤的生长

3．4结论与讨论

参考文献

第4章针对CML／V299L耐药突变的高活性高选择性BCR-ABL激酶抑制剂CHMFL-ABL-037的发现研究

4．1研究背景

4．1．1 CML流行病学简介

4．1．2 BCR-ABL融合简介

4．1．3 BCR-ABL激酶抑制剂研究进展

4．1．4研究背景小结

4．2实验材料和方法

4．2．1实验仪器及耗材

4．2．2 CHMFL-ABL-039合成路线

4．2．3实验材料

4．2．4实验方法

4．3实验结果

4．3．1 CHMFL-ABL-039是一个高活性高选择性的BCR-ABL激酶抑制剂

4．3．2 CHMFL-ABL-039对细胞增殖活性的检测

4．3．4 CHMFL-ABL-039对BCR-ABL介导的信号通路影响

4．3．5 CHMFL-ABL-039对细胞周期的影响

4．3．6 CHMFL-ABL-039对细胞凋亡的影响

4．3．7 CHMFL-ABL-039抑制K562／BaF3-BCR-ABL-V299L异体移植瘤的生长

4．4结论与讨论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果